纳秒与微秒脉冲电场诱导磷脂酰丝氨酸外翻的特征比较

《The Journal of Membrane Biology》：Peculiarities of Phosphatidylserine Externalization by Nano- and Microsecond Electric Pulses

　　

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）外翻是细胞凋亡的标志，但也可在数秒内由脉冲电场（pulsed electric fields, PEFs）触发。PS通过电穿孔横向迁移至外小叶，还是通过Ca²⁺依赖性信号传导及 scramblase 激活间接到达外小叶，目前仍有争议。研究人员采用全内反射荧光（total internal reflection fluorescence, TIRF）显微镜结合 Annexin V-Alexa Fluor 568 和/或牛乳黏附素（bovine lactadherin）-FITC，对置于氧化铟锡（indium tin oxide, ITO）透明电极上的 HEK293 细胞中的 PS 外翻进行解析。PEF 暴露后，在 20 μs 脉冲（1.2–2.5 kV/cm）后约 10 s 内，或在 400 ns 脉冲（9.3–13.7 kV/cm）后约 1 min 延迟，产生离散的 PS 阳性点状结构（"雀斑"）。其数量逐渐增加，在 5 min 内达到每 100 μm² 细胞膜面积 80–120 个雀斑。雀斑呈圆形，中心最亮，可用高斯强度分布很好地描述，尽管峰值强度差异高达约 50 倍，但其半高全宽（full width at half maximum, FWHM）始终约为 0.35 μm。在 Ca²⁺ 游离培养基中，雀斑形成受到抑制，但可通过施加更高强度的 20 μs PEF 部分恢复。许多雀斑以明显随机的方式横向和轴向移动，而另一些则保持空间受限。雀斑均匀的大小和形状及其运动模式提示其为 PS 阳性囊泡而非 PS 膜斑块。进一步分析将雀斑鉴定为直径约 200 nm 的细胞外囊泡，其形成由高于电穿孔阈值的 PEF 强度触发。

## 论文解读

### 研究背景与问题

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS) 通常由 ATP 依赖性脂质转运蛋白限制在质膜（plasma membrane, PM）的胞质侧。PS 不对称性的丧失及其向细胞表面的转位是生理和病理过程中的关键信号，包括凋亡细胞的识别与清除、凝血调控以及免疫应答的激活。在活细胞实验中，表面 PS 通常由荧光标记的 PS 结合蛋白检测，如依赖 Ca²⁺ 的膜联蛋白 V（Annexin V) 和不依赖 Ca²⁺ 的乳黏附素（lactadherin, 又称 MFG-E8）。PS 检测被广泛用作凋亡承诺的操作性标志物。

PS 外翻也是电穿孔（electroporation）的一个已确立后果。高强度脉冲电场（PEFs) 瞬时通透化质膜，使离子流得以通过并启动 Ca²⁺ 依赖性信号传导。早期关于纳秒 PEF（nsPEFs) 后快速广泛 PS 外翻的报道将其解释为凋亡的标志，并视其为 nsPEF 治疗以凋亡为主流结果的证据。然而后续研究挑战了这一解释，表明 PS 外翻可在数秒内发生——该时间尺度与凋亡程序不相容——且与膜通透化和 Ca²⁺ 内流紧密相关。Ca²⁺ 通过电穿孔的流入可激活磷脂 scramblase，迅速瓦解脂质不对称性并驱动 PS 至外小叶。同时，电穿孔提供了连续的脂质-水界面，可能使内小叶 PS 沿孔壁通过 "横向漂移"（lateral drift）发生不依赖 Ca²⁺ 的脂质重排至外膜表面。

研究人员近期证明单个电穿孔可持续数百毫秒甚至数十秒，这与分子模型建议的 PEF 关闭后电穿孔在纳秒至微秒内湮灭形成鲜明对比。这一差异可用长寿命电穿孔形成于膜蛋白而非脂质的假设来解释。PS 通过横向扩散的外翻仅可能在脂质孔中发生，而在假设的蛋白性电穿孔中将不会发生。因此，本研究最初旨在检验 PS 外翻模式是否与横向扩散机制一致（与电穿孔共定位及从初始焦点横向扩散），以确认或否定电穿孔的脂质本质。

### 研究开展与主要结论

然而，研究人员观察到一种独特的点状 PS 外翻特征，表现为众多亚微米 PS 阳性斑点（"雀斑"，freckles）的形成，其具有高度均匀的表观大小和可变的运动性。研究分析了它们的出现时间进程、亮度、运动性和 Ca²⁺ 依赖性，发现这些特征最符合从细胞脱落的 PS 阳性细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs)。尽管这一结果未能解决电穿孔是脂质性还是蛋白性的问题，但它鉴定出了一种此前未知的 PEF 响应——PS 外翻通过囊泡脱落实现——这对基因电转移和肿瘤消融等医学应用具有潜在意义。该论文发表于《The Journal of Membrane Biology》。

### 主要关键技术方法

HEK293 细胞培养于 ITO 涂层玻璃盖玻片上，采用单脉冲 400 ns（9.3–16.8 kV/cm）、2 μs（5 kV/cm）或 20 μs（0.6–6.2 kV/cm）脉冲电场处理。利用配备 cellTIRF MITICO 照明器和 100×/1.50 NA 油浸物镜的 Olympus IX83 倒置显微镜进行全内反射荧光成像，激发光为 488 nm 和 561 nm 激光，图像采集使用 Orca-Quest 2 光子计数 qCMOS 相机（像素尺寸 46×46 nm）。PS 外翻由 Annexin V-Alexa Fluor 568 和/或牛乳黏附素-FITC 标记；胞质 Ca²⁺ 由 Cal-520 AM 指示；细胞外液标记用 FITC-葡聚糖（10 kDa, 50 μg/mL）。110 nm TetraSpeck 荧光微球用于测量点扩散函数（point spread function, PSF）。图像分析采用 MetaMorph 7.7、OlyVIA 3.1 或 Fiji/ImageJ 软件，通过高斯拟合提取雀斑的半高全宽（FWHM）等参数。

### 研究结果

**PEF 暴露后 PS 外翻呈点状模式**

与先前报道的 PEF 诱导 PS 外翻为相对缓慢且弥散的过程不同，研究人员采用高分辨率 1.5 NA 物镜的 TIRF 显微镜，观察到多个清晰界定的 PS 外翻点状结构——"雀斑"。400 ns 脉冲在 ≥9 kV/cm 时，雀斑通常在 ~1 min 延迟后发展，随后数分钟内数量增加而大小不变；20 μs 脉冲在 0.6–2.5 kV/cm 产生类似的点状荧光模式，更强脉冲可在 10 s 内诱导首批雀斑。高强度 4.4 kV/cm、20 μs 脉冲则因雀斑过多而难以分离个体进行分析。

**雀斑出现的时间进程、特性及 PEF 参数依赖性**

通过 10×10 μm 感兴趣区（ROI）的自动化检测进行定量分析。400 ns PEF 在 5 kV/cm 时产生 <10 个/ROI 雀斑，与假处理组无显著差异；9.3 和 13.7 kV/cm 则分别诱导 ~40 和 ~80 个/ROI，累积积分强度在 9.3 kV/cm 时 3 min 内趋于稳定，13.7 kV/cm 时持续上升。20 μs 脉冲在 0.6、1.2 和 2.5 kV/cm 诱导的雀斑数量与 400 ns 脉冲相当，但无延迟时间，且累积积分强度高达 10 倍，平均强度高约 5 倍。雀斑峰强度和变异性在 400 ns 和 20 μs PEF 间存在显著差异，提示两种 PEF 效应本质上不同，不能由单一标准描述。

**乳黏附素与膜联蛋白检测 PS 外翻的比较**

为检验 Ca²⁺ 在雀斑形成中的作用，研究人员使用不依赖 Ca²⁺ 的 FITC-乳黏附素替代膜联蛋白 V。乳黏附素揭示了类似的点状 PS 外翻模式，但与膜联蛋白标记仅部分共定位（30–60%），乳黏附素标记常更靠近细胞边缘，可能与其较大分子尺寸及向盖玻片和细胞底部间隙的较低渗透效率有关。

**去除胞外 Ca²⁺ 抑制雀斑形成**

在含 2 mM Ca²⁺ 的介质中，400 ns 脉冲于 9.3–13.7 kV/cm 或 20 μs 脉冲均可诱导多个 PS 阳性点；但在 Ca²⁺ 游离缓冲液（含 2 mM EGTA）中，400 ns 脉冲即使高达 16.8 kV/cm 也未诱导任何雀斑。20 μs PEF 在高强度时（6.2 kV/cm 3/3 细胞，4.4 kV/cm 6/12 细胞）仍能诱导雀斑，但效率远低于含 Ca²⁺ 条件（1.2 kV/cm 即可产生相当或更强的 PS 外翻）。这证明 Ca²⁺ 对 PEF 诱导的雀斑形成起关键作用；高强度 PEF 在无胞外 Ca²⁺ 时仍能触发 PS 外翻，可能与 PEF 诱导的胞内 Ca²⁺ 库动员有关。

**雀斑的运动性**

通过时序图像叠加分析，研究人员发现雀斑呈现随机的空间运动。以 400 ns、9.3 kV/cm 脉冲后 66 s 的图像为参照，28 个雀斑中 50% 在 5 s 内已发生移位；20 μs、1.2 kV/cm 处理的实验中，个别雀斑在 10 s 间隔的连续图像中保持不动，而周围雀斑持续运动。两个雀斑可相互靠近 "接触" 后再分离，亮度无明显变化——这种运动要求膜在雀斑间急剧折叠，而不将雀斑自身拉离玻璃基底。此外，邻近雀斑的亮度波动异步且独立，提示垂直方向的运动。这些特征难以用质膜上的 PS 斑块解释，而提示雀斑并非必然与细胞膜相连。

**高斯拟合测得的雀斑大小几乎恒定且与亮度无关**

直接由图像判断雀斑大小具有欺骗性，因为表观大小取决于视觉亮度及查找表（LUT）设置。利用像素强度的高斯分布特性，通过 FWHM 定义大小更为可靠。结果显示，三个代表性雀斑的 FWHM 基本与像素强度无关，几乎恒定（0.3–0.4 μm）。若雀斑为质膜中的 PS 斑块，PS 的横向扩散（扩散系数 ~0.2–1 μm²/s）预计会在数分钟内产生微米尺度的弥散；因此，本质上恒定的 FWHM 为雀斑是囊泡而非 PS 斑块提供了强有力证据。

**由 FWHM 推导雀斑大小**

鉴于 FWHM 值接近衍射极限，研究人员采用 110 nm 荧光微球实验测定有效点扩散函数（PSF），而非依赖理想化理论值。对于 570 nm 激发/630 nm 发射设置，测得微球 FWHM_bead,meas = 308 nm，经 TIRF 穿透深度 d=100 nm 校正后，计算有效 PSF 宽度 FWHM_PSF ≈ 289 nm。对平均测量 FWHM 350 nm 的雀斑进行去模糊处理后，转换为物理直径 D ≈ 210 nm。488 nm 激发/530 nm 发射设置下，估计物理直径约 160 nm。这些差异归因于方法学不确定性而非实际大小差异。总体而言，多数雀斑与约 200 nm 直径的亚微米囊泡一致，少数过大雀斑（FWHM 达 400–450 nm）可能代表双联体或重叠的小雀斑。

**雀斑为细胞外囊泡**

为区分内吞、外排或外泌体分泌机制，研究人员在含 Annexin V-Alexa Fluor 568 的同时加入 FITC 标记的 10 kDa 葡聚糖（流体力学半径 ~2 nm，不进入电穿孔细胞）。PEF 前，细胞表现为明亮背景下的暗轮廓；400 ns、6.2 kV/cm 脉冲后产生大量或中等数量的 Annexin 阳性雀斑。在 ~10 min 时灌流无染料生理液后，胞外荧光显著减少或消失，雀斑内未检测到葡聚糖-FITC 信号。部分 Annexin 阳性和葡聚糖阳性点状结构共存但从不共定位，表明 Annexin 阳性雀斑起源于细胞内部、未捕获胞外 FITC-葡聚糖，由外排或胞吐作用形成；而葡聚糖阳性点状结构可能为 PS 阴性的内吞囊泡。

**雀斑在超电穿孔阈值强度形成**

为确定雀斑形成在已知电穿孔强度尺度上的位置，研究人员以胞质 Ca²⁺ 升高作为敏感终点（HEK 细胞缺乏电压门控 Ca²⁺ 通道）。400 ns 和 20 μs 脉冲分别在 2.4 kV/cm 和 0.33 kV/cm 产生统计学显著反应，两倍于各自的雀斑诱导阈值。这证明雀斑在高于电穿孔阈值的电场强度下形成，支持其为电穿孔下游后果的解释，但确切通路尚待确定。

**反向电场极性同样有效触发雀斑形成**

PS 带负电荷，其外翻机制之一讨论为向阳极的电泳漂移。当 ITO 表面相对于上方杆电极为负（阴极）时，该机制已难以解释。进一步测试相反极性（ITO 为正）发现，400 ns PEF 在 6.2 kV/cm 下触发的 PS 外翻在质上与原极性相似，未见效率明显增加或模式差异。这初步排除了 PS 向阳极电泳漂移的主导作用，也反对极性依赖性脂质氧化对雀斑形成的主要贡献。此外，多次实验观察到雀斑在细胞边界外积聚，进一步支持其细胞外囊泡的解释。

### 讨论与结论

本研究首次将 TIRF 显微镜应用于分析电穿孔 PEF 的 PS 外翻。与先前众多报道的弥散 PS 外翻不同，研究人员观察到主导的、甚至可能是唯一的点状模式。这些点状结构被进一步鉴定为直径约 200 nm 的细胞外 PS 阳性囊泡。这一小尺寸接近衍射极限，可能是此前常规荧光成像未能解析的原因；另一原因是常见实验配置中电极置于细胞两侧，即使高分辨率成像也会将多个相邻事件融合为弥散信号。本研究的实验配置允许对基底膜进行选择性成像、背景最小化，从而将 PS 外翻揭示为离散个体事件。

研究数据不支持 PS 通过电穿孔横向漂移到达外小叶的假设——该机制预期产生局部径向扩展的 PS 斑块，而非在多数电穿孔重新封闭后仍持续数分钟出现的 PS 阳性囊泡。脉冲极性未定性影响雀斑形成，反对 PS 跨膜电泳运动的主导作用。与早期应用多脉冲、更短脉冲高场强（4–30 ns, 25–80 kV/cm）的研究不同，本研究使用单脉冲 400 ns 或 20 μs、最高 16.8 或 6.2 kV/cm，PS 外翻并非由膜起泡介导，不支持膜起泡基部及顶端受限脂质堆积区域转位 PS 的机制。最后，质膜相邻 ITO 电极的脂质氧化呈强脉冲极性依赖，而雀斑形成并非如此，因此脂质氧化不太可能介导 PS 外翻和囊泡脱落。

相反，囊泡化对胞外 Ca²⁺ 的强烈依赖，以及囊泡化高于电穿孔的表观阈值，与电穿孔性 Ca²⁺ 进入及随后 Ca²⁺ 依赖性 scramblase（如 TMEM16F）激活一致。该机制暗示质膜局灶性 PS 外翻导致膜膨出继而囊泡断裂，尽管这尚待证实。Scramblase 也可能被包裹于雀斑内，在从质膜断裂后仍保持活性。

雀斑亮度差异显著，尤其在 400 ns 和 20 μs 暴露间。TIRF 成像中强度不能仅解读为每囊泡 PS 量，因其还取决于囊泡在倏逝场中的位置、探针可及性、囊泡大小、膜曲率及可能的重叠。个体雀斑数倍亮度波动伴随近乎恒定的 FWHM，提示轴向运动对强度变化有贡献。20 μs 脉冲后更亮的雀斑可能反映囊泡形成、标记或定位的差异，但其机制基础尚待解决。

雀斑形成可能代表膜修复响应而非纯粹的病理副产品。囊泡脱落是去除受损质膜、恢复膜完整性的已确立机制。因此，雀斑可能反映电穿孔损伤膜区域的局部切除和处置。从此角度看，PEF 暴露可能为以高时空精度探测膜修复提供有用工具。或者，雀斑可能代表响应胞质 Ca²⁺ 升高从多泡体（MVBs）释放的外泌体，HEK293 细胞具备功能性 MVB 通路并已知释放外泌体类型囊泡。然而，400 ns 和 20 μs PEF 诱导雀斑在亮度和群体异质性上的显著差异，似乎与外泌体释放机制不一致，而更可能与 "短" 和 "长" PEF 后不同的 Ca²⁺ 动态相关。

研究结论：本研究提供了首个将 PEF 处理细胞中 PS 外翻与囊泡脱落相关联的证据。囊泡脱落的机制、囊泡货物及其对 PEF 基础治疗的潜在意义，将作为后续研究的优先方向。