《Tropical Animal Health and Production》：Genetic diversity of bovine coronaviruses from recurrent outbreaks on a large-scale cattle farm
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本研究旨在阐明2024年土耳其某大规模奶牛场三次呼吸道暴发期间（1月、5月和8月)检测到的牛冠状病毒（Bovine Coronavirus, BCoV）的分子特征。三次暴发均记录到呼吸道症状，其中8月暴发还伴有肠道感染。研究人员共分析52份样本(42份鼻拭子样
本研究旨在阐明2024年土耳其某大规模奶牛场三次呼吸道暴发期间（1月、5月和8月)检测到的牛冠状病毒（Bovine Coronavirus, BCoV）的分子特征。三次暴发均记录到呼吸道症状，其中8月暴发还伴有肠道感染。研究人员共分析52份样本(42份鼻拭子样本和10份粪便样本)，采用靶向核衣壳（Nucleocapsid, N）基因的RT-nestes PCR（逆转录巢式聚合酶链反应）检测，13份样本(12份鼻拭子样本和1份粪便样本)呈阳性。在可从1月(n=1)和8月(n=5)暴发中获得的部分N基因序列中，8月暴发的两序列在RS/SR结构域表现出三氨基酸缺失。此外，来自1月和8月暴发两样本的部分刺突（Spike, S）基因序列揭示不同的氨基酸替换。观察到的遗传变异表明该场不同暴发事件中存在遗传上不同的BCoV毒株，支持在 cattle farming systems（奶牛养殖系统）中持续开展分子监测的必要性。
牛冠状病毒（BCoV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）、埃姆贝科病毒亚属（Embecovirus）、β冠状病毒属（Betacoronavirus）的β冠状病毒1种（Betacoronavirus 1，亦称Betacoronavirus gravedinis），是一种肺肠病毒，可引致牛呼吸道与肠道双重感染。BCoV感染的临床症状包括发热、呼吸窘迫、频繁咳嗽、鼻分泌物、腹泻、脱水和食欲不振等。该病毒通过粪便和呼吸道分泌物传播，在集约化生产系统中高效传播和持续存在，导致反复暴发。N蛋白参与病毒致病、转录和复制等多个关键过程，因其高度保守且在复制期间大量表达，靶向BCoV N基因的RT-PCR检测常用于临床样本病毒检测。S蛋白由S基因编码，具有两项主要功能：一是利用其N端信号序列进入宿主细胞内质网；二是促进病毒附着于宿主细胞。基因组中位于768和769位氨基酸之间的蛋白酶切割位点将S蛋白分为S1和S2两个亚单位，S1亚单位包含受体结合域（Receptor-Binding Domain, RBD），介导病毒与宿主细胞受体附着，S2亚单位形成茎样结构，介导病毒与细胞膜融合——这是病毒进入宿主细胞的关键步骤。目前关于BCoV感染临床表现差异是否与N蛋白和S蛋白氨基酸变异有关，以及特定替换与疾病表型之间是否存在明确因果关系，仍存在争议。
在土耳其，多项研究已报道冠状病毒是牛呼吸道和肠道感染的病原之一，也有研究提供了来自不同器官系统的冠状病毒特定基因区域或全基因组序列数据，但关于集约化生产系统中牛冠状病毒分子特征的循证数据仍然有限。基于此，研究人员开展本项研究，旨在描述2024年土耳其某大规模奶牛场三次呼吸道暴发（1月、5月和8月）的背景和纵向观察结果，并对三次呼吸道暴发中检测到的BCoV进行分子分析——最后一次暴发还与腹泻暴发相关。
样本来源于土耳其卡斯塔莫努省某 herd size（群体规模）为2000头的荷斯坦奶牛场，采用半开放式饲养系统。据农场管理人员提供信息，最近一次引入新动物是在2023年。犊牛单独饲养于农场设施内的犊牛栏中，妊娠母牛按计划常规接种牛轮状病毒和牛冠状病毒疫苗。1月和5月暴发时受影响犊牛月龄为3-4个月，8月暴发涉及0-3月龄犊牛，且伴有呼吸和肠道双重感染。研究人员共收集52份样本(10份粪便和42份鼻拭子样本)，1月15份和5月12份均为鼻拭子样本，8月收集15份鼻拭子样本和10份粪便样本。样本采集经兽主同意，全程冷链运输至实验室，-80°C保存待检。
在检测方法上，研究人员采用酚/氯仿法或TRIzol? LS Reagent从鼻拭子上清液或10倍稀释粪便样本中提取核酸，使用RevertAid first-strand cDNA synthesis kit进行逆转录，继而对N基因进行RT-nestes PCR扩增，第一轮回扩增产物约730 bp，第二轮回约407 bp。对N基因阳性样本，进一步采用九对重叠引物对S基因区域（S1和S2亚单位）进行RT-PCR扩增。所有扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳、SafeView Classic染色后紫外光下观察，预期大小扩增子进行双向测序。序列分析使用AliView软件与GenBank参考序列比对，利用MEGA X软件基于Akaike Information Criterion (AIC)和Bayesian Information Criterion (BIC)选择最佳模型的最大似然法构建系统发育树，N基因采用Kimura 2-parameter model with gamma distribution (K2P+G)，S基因采用Tamura-Nei model with gamma distribution and proportion of invariant sites (TN93+G+I)，bootstrap值均为1000次重复，并进行氨基酸水平比对。
研究结果显示，52份样本中12份鼻拭子样本BCoV阳性(包括1月1份、5月4份、8月7份)，8月另有1份粪便样本阳性，表明三次暴发期间均存在BCoV。序列成功获得6份(1月1份、8月5份)，GenBank登录号分别为BCoV/S2 (PV975811)、BCoV/3246 (PV975812)、BCoV/3243 (PV975813)、BCoV/3330 (PV975814)、BCoV/3185 (PV975815)和BCoV/A1 (PV975816)。基于第一轮PCR序列的系统发育树显示，BCoV/S2与既往土耳其报道的BCoV毒株聚类，而BCoV/3243和BCoV/3246形成独立分支；BCoV/3243与BCoV/3246 100%相同，与BCoV/S2核苷酸相似性为97.39%。六条N基因序列核苷酸和氨基酸相似性分别为98.58%-100%和99.02%-100%。氨基酸分析发现8月样本BCoV/3243和BCoV/3246在RS/SR结构域存在相同的三氨基酸缺失("RAS")，而1月样本BCoV/S2无此缺失；8月另外三样本(BCoV/3185、BCoV/3330、BCoV/A1)因第一轮PCR产物未能获得而无法评估该缺失，但序列比对显示存在N156T氨基酸替换。S基因分析从BCoV/S2和BCoV/3246成功获得部分序列(分别缺失80和110个氨基酸)，二者均聚类于GIb亚群，核苷酸相似性98.55%，氨基酸相似性98.72%。以Mebus参考株比对，S1结构域（438-599位氨基酸）发现两株共有替换(V465A、H470D、S484T、N509T、N531D、S543A、Y571H)和株特异性替换：BCoV/3246特有的D492G和S510T，以及BCoV/S2特有的N499S、P501F和H525Y。
讨论部分，研究人员指出BCoV在三次暴发中均被检出，且未检测到其他主要呼吸道病毒，提示BCoV可能是该场呼吸道暴发的主要病原。尽管存在常规母源免疫，8月仍检测到BCoV及轮状病毒阳性，这可能反映 calves（犊牛）被动保护不完全或田间毒株遗传多样性。研究特别关注N基因和S基因的分子特征：8月两毒株RS/SR结构域的三氨基酸缺失亦见于GenBank中来自肠道或呼吸道样本的12株BCoV分离株，其中NXWZ2310株与严重呼吸道和肠道疾病相关，但基于当前数据集无法建立直接因果关系。N156T替换仅见于8月部分毒株，可能提示不同变异株同时循环或新毒株引入。S基因系统发育分析将BCoV主要分为GI和GII两大群，本研究两株均属于GIb亚群。S510T替换尤其值得关注，该替换常见于韩国和日本GII群多数毒株，与受体亲和力和血凝特性改变有关，被认为可能是呼吸道嗜性的标志之一，但其与组织嗜性的关系尚未定论。研究局限性包括成功获得序列数量有限、5月暴发未能获得序列、仅单一场点研究以及缺乏全基因组数据，这些均限制了深入解析进化关系和功能解释。
研究结论：基于部分N基因和S基因序列分析，本研究表明遗传不同的BCoV毒株可随时间在同一规模化牛场内循环，尽管未探讨其对临床严重程度、病毒载量或其他相关因素的潜在影响。未来研究需纳入更多基因组区域、全基因组测序及功能分析，以更好理解BCoV的流行病学特征和生物学特性。该论文发表在《Tropical Animal Health and Production》。
