环介导等温扩增-侧流层析试纸条(Loop-mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick, LAMP-LFD)检测葡萄酒微生物

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Loop-mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick (LAMP-LFD) for detection of wine microorganisms

　　

葡萄酒无疑是最古老且最受推崇的饮品之一，主要由葡萄经酵母将糖转化为酒精的发酵过程酿制而成。 unwanted微生物的存在会导致葡萄酒变质，因此早期检测微生物至关重要。既往报道的传统方法及分子生物学方法存在耗时、昂贵等缺点，难以在葡萄酒工业中广泛应用。为此，研究人员提出了一种新型广谱环介导等温扩增联合侧流层析试纸条(LAMP-LFD)检测方法，用于快速检测葡萄酒相关微生物。本研究的创新点在于设计并改造了标记生物素(biotin)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)的广谱LAMP引物组，可同时检测葡萄酒腐败微生物(包括醋酸菌和乙酸酒香酵母属(Brettanomyces)真菌)以及有益发酵微生物(如乳酸菌和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，扩增产物可在LFD试纸上即时显色。结果表明，所设计引物在优化条件下对葡萄酒相关微生物具有特异性。新建LAMP-LFD方法的检测灵敏度可达102CFU/mL，优于市售聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)。该LAMP-LFD检测方法是葡萄酒工业的重要进展，可为保障葡萄酒质量提供可靠高效的手段。研究人员认为该方法是一种有前景的概念验证工具，可进一步开发并在葡萄酒工业中验证应用。

论文解读：《Loop-mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick (LAMP-LFD) for detection of wine microorganisms》发表于《World Journal of Microbiology and Biotechnology》

葡萄酒是由酵母将葡萄中糖分转化为酒精的复杂生物技术产品，涉及酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation, MLF)。除酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)外，乳酸菌如酒酒球菌(Oenococcus oeni)执行MLF可将苹果酸转为乳酸以降低酸度并改善感官特性。然而，醋酸菌(Acetobacter、Gluconobacter)、酒香酵母(Brettanomyces/Dekkera)、某些乳酸菌及丝状真菌可导致葡萄酒腐败，产生挥发酸、乙基酯或霉菌毒素，影响品质与安全。传统培养法和显微镜检查耗时较长；基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的分子检测虽灵敏但需热循环仪、昂贵试剂及专业实验室，且葡萄酒基质中多酚、乙醇、SO?可能抑制反应。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)可在恒定温度下快速扩增核酸，无需复杂仪器，但常用显色法在低浓度时判读困难，电泳法则需额外设备。将LAMP扩增产物与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick, LFD)结合(LAMP-LFD)，利用标记探针在试纸条上形成可视条带，可提高结果判读便利性。目前针对葡萄酒相关微生物设计广谱(broad-range) LAMP引物并整合LFD读取的研究仍较缺乏。为此，研究人员开发了基于广谱及特异引物的LAMP-LFD检测体系，用于快速、特异、灵敏地检测葡萄酒中关键发酵及腐败微生物，并通过纳米金(AuNPs)降低非特异性扩增，评估其性能。

主要关键技术方法

研究人员选取葡萄酒相关标准菌株(包括Gluconobacter oxydans、Oenococcus oeni、Acetobacter aceti、Lactiplantibacillus plantarum、Saccharomyces cerevisiae、Hanseniaspora uvarum、Metschnikowia pulcherrima、Lachancea thermotolerans及Brettanomyces bruxellensis)，接种于红酒后采用破碎细胞法(broken-cell method)直接提取基因组DNA。针对细菌16S rRNA基因设计广谱Panbacteria引物及Oenococcus属特异引物，针对真菌ITS区设计广谱Panfungal引物(引自Inácio et al. 2008)及Saccharomyces cerevisiae种特异引物，使用Primer Explorer V5和GLAPD软件设计，内引物分别标记biotin(FIP/BIP)和FITC(FIP)，经Primer-BLAST与MEGA-X验证。LAMP反应体系(25 μL)含dNTPs、内外引物、loop引物、MgSO?、Isothermal Buffer、Bst 2.0 DNA Polymerase及5 nm金纳米颗粒(gold nanoparticles, AuNPs)，62℃孵育30 min。LAMP产物与Milenia? GenLine HybriDetect LFD试纸条孵育，观察质控线(C线)与检测线(T线)。通过特异性试验(靶/非靶/阴性对照)、灵敏度(系列梯度10⁸~10²CFU/mL细胞浓度)及重复性(三次重复)评价方法性能，并以2%琼脂糖凝胶电泳佐证。

Primer designing and validation（引物设计与验证）

研究人员基于细菌16S rRNA基因和真菌内部转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)区域，利用GLAPD及Primer Explorer V5设计了四套LAMP引物：Panbacteria(广谱细菌)、Panfungal(广谱真菌)、Oenococcus spp.特异及Saccharomyces cerevisiae特异引物，内引物分别标记biotin与FITC。经Primer-BLAST与MEGA-X序列比对验证，确认引物靶向特异性及无显著脱靶同源序列。

LAMP assay specificity（LAMP assay特异性）

研究人员比较加与不加AuNPs的LAMP反应，发现加入5 nm AuNPs可有效减少非特异性扩增，避免不加AuNPs时偶尔出现的假阳性信号，从而提高检测特异性。

LAMP-LFD assay validation（LAMP-LFD assay验证）

研究人员以约6×10⁸CFU/mL各目标微生物DNA为模板进行LAMP扩增，取产物经LFD试纸条检测。结果显示阴性对照仅显示C线，所有靶微生物在对应引物下均出现C线与T线双条带；同期2%琼脂糖凝胶电泳呈梯状 smear 条带，阴性对照无条带，证实LAMP-LFD体系可有效检出靶微生物。

LAMP-LFD specificity（LAMP-LFD特异性）

研究人员分别以靶标DNA、非特异DNA及无模板阴性对照进行LAMP-LFD检测。结果表明仅含靶标DNA的反应在LFD上显示T线，非特异DNA及阴性对照仅见C线；凝胶电泳亦仅靶标出现扩增条带。四套引物(Panbacteria、Panfungal、Oenococcus spp.特异、Saccharomyces cerevisiae特异)均无交叉反应，证明引物具高度特异性。

LAMP-LFD detection limit（LAMP-LFD检测限）

研究人员对每种微生物进行10⁸、10⁶、10⁴、10²CFU/mL活菌梯度稀释并开展LAMP-LFD检测。结果显示在10²CFU/mL浓度下三次重复均为阳性(LFD双线及凝胶阳性)，10¹及10⁰CFU/mL未检出。故确定该LAMP-LFD方法检测限为10²CFU/mL。

讨论部分总结

研究人员指出传统培养法与PCR在葡萄酒应用中受限于耗时、成本及对设备与实验室环境的要求，且葡萄酒基质成分可能抑制PCR。本研究建立的LAMP-LFD整合了广谱与特异引物，可同时监控总体微生物群及关键发酵/腐败菌种，简化DNA制备(破碎细胞法)使现场应用成为可能。引入AuNPs降低了LAMP非特异性扩增及假阳性率。该方法检测限达10²CFU/mL，优于或等同于文献报道的葡萄酒微生物分子检测法，整个流程可在约1小时内完成，仅需恒温水浴(或简单加热块)与LFD试纸条，成本低廉。局限性包扩不能定量、未实现多重检测(因LFD单次识别一种标记产物)、葡萄酒复杂基质(高乙醇、SO?、酚类)对不同酒样的影响需更多验证，及Oenococcus属LFD验证仅用O. oeni一株。未来需在更多酒样基质及近缘菌种中验证，并开发多重及定量LAMP-LFD体系。

结论(翻译)

本研究提出一种经金纳米颗粒增强的LAMP-LFD检测方法，作为快速、灵敏、特异地检测葡萄酒腐败及发酵微生物的工具。通过结合广谱与靶向引物组，该方法既可全面监测微生物群落也可精确检测关键分类单元。该检测达到低检测阈值(10²CFU/mL)、高特异性及清晰的可视化读出，凸显其在葡萄酒工业中实际应用的潜力。除技术性能外，该方法解决了酿酒过程中一个关键挑战——及时且经济高效地检测腐败微生物，其推广有助于减少经济损失、维持葡萄酒品质并增强消费者信心。