基于光子晶体增强单颗粒上转换发光用于女性癌症生物标志物超灵敏多元检测

《PhotoniX》：Ultrasensitive multiplexed detection of women’s cancer biomarkers based on photonic crystal-enhanced single-particle upconversion

　　

乳腺癌与卵巢癌标志物的定量检测对女性健康早期筛查至关重要，但目前仍缺乏快速且高灵敏度的女性相关肿瘤标志物多元检测策略。本研究提出一种通过将单核壳结构上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticle, UCNP）与上光子晶体（photonic crystal, PC）腔集成，实现上转换（upconversion, UC）发射颜色的调谐与选择性增强。实验与理论结果表明，单个UCNP周围的激发光场调制是PC效应调控UC发射变化的主导因素。研究人员基于此设计了基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）效应的PC腔增强单UCNP微流控器件，用于双通道肿瘤标志物检测。作为概念验证，该器件被用于乳腺癌标志物miRNA-155的定量检测及卵巢癌标志物的多元检测，具有高灵敏度与高特异性。该生物传感器实现了较宽的线性检测范围，下限分别为：miRNA-155 (1 pM–0.6 nM)、CA125 (0.002–1.8 U/mL)及HE4 (0.008–85.5 ng/mL)。本工作为实现单颗粒UC调控提供了强有力策略，并为各类肿瘤标志物高灵敏度多通道检测开辟了新途径。

一、研究背景与意义

乳腺癌与卵巢癌分别是全球女性中发病率最高与致死率极高的妇科恶性肿瘤，确诊时多为晚期是导致高死亡率的主因，因此早期准确检测对改善临床预后至关重要。血清生物标志物在恶性肿瘤诊断、疗效评估及预后判定中具有重要价值，但单一标志物灵敏度与特异性较低，多元联合检测成为趋势。传统检测方法如电化学发光、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）及定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）存在样品前处理复杂、仪器成本高及平台标准化不足等局限；常规荧光探针受生物样本内源自发荧光干扰大，降低检测准确度。镧系掺杂上转换纳米颗粒（lanthanide-doped upconversion nanoparticle, UCNP）具有近红外激发、无背景荧光干扰、光稳定性好等优势，适于生物分析，但基于固定组分单UCNP调控其发射颜色仍是难点，现有多元检测多依赖不同掺杂的多类UCNP，探针合成与信号解析复杂。本研究在《PhotoniX》发表，旨在通过光子晶体（photonic crystal, PC）腔与单核壳UCNP耦合产生的局域光场增强效应，实现单颗粒上转换发光（upconversion luminescence, UCL）的颜色调谐与信号放大，构建高灵敏度、单通道多元检测的微流控生物传感平台，用于乳腺癌miRNA及卵巢癌蛋白标志物的超灵敏检测。

二、主要关键技术方法

研究人员采用高温溶剂热两步法合成NaYF₄:20%Yb³⁺,0.1%Tm³⁺@NaYF₄:20%Yb³⁺,1%Ho³⁺核壳UCNP；以聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate, PMMA）模板法结合溶胶-凝胶法制备光子禁带中心约980 nm的氧化锌反蛋白石光子晶体（ZnO inverse opal photonic crystal, ZnO IOPC），将稀释UCNP浸入形成单UCNP@PC腔杂化物；通过时域有限差分（finite-difference time-domain, FDTD）法模拟980 nm光电场分布；以盐酸剥离油酸配体获得水溶性配体游离UCNP，通过寡核苷酸探针或聚多巴胺（polydopamine, PDA）修饰制备FRET供体探针，以MoS₂纳米片或适配体修饰金纳米颗粒（aptamer-modified Au nanoparticles, Apt-Au NPs）作受体构建猝灭体系；制作集成PC腔的单通道微流控芯片，以980 nm激光激发，单分子共聚焦荧光系统采集UCL光谱与荧光寿命；采用加标回收与临床人血清样本（10例健康、10例卵巢癌患者）验证实用性。

三、研究结果

PC cavity enhances and colour-tunes single UCNP emission（光子晶体腔增强并调谐单UCNP上转换发光）

透射电镜（high-resolution transmission electron microscopy, HR-TEM）与能谱映射（energy-dispersive X-ray, EDX mapping）证实约300 nm核壳UCNP具清晰核壳结构与元素分区；SEM确认单UCNP定位于IOPC腔中心且PC光子阻带（photonic stop band, PSB）与Yb³⁺激发带～980 nm重叠。对比单UCNP与UCNP薄膜，单颗粒在高低功率下核（Tm³⁺）与壳（Ho³⁺）发射行为不同，FDTD显示单UCNP表面散射致局域电场增强使激发光更易穿透壳层激活核内敏化剂，薄膜因多重散射改变能量传递路径。单UCNP耦合PC腔后整体UCL增强约5倍，核发射增强7.5倍、壳发射增强4.5倍，导致核壳强度比改变并肉眼可见色移，三光子跃迁（¹G₄-³H₆）增强因子可达13倍；30个单颗粒统计增强因子均值4.9±1.1，且在非饱和区功率恒定下增强因子不变；荧光寿命在各发射带无明显变化，证实增强源于PC诱导激发电场局域放大（|E|²增强约2.5倍）而非Purcell效应，UCL强度满足I∝|E|²ⁿ（n为参与填充发射能级的光子数），实现固定组分单UCNP发射颜色调谐。

Breast cancer biomarker detection using a PC-enhanced single-UCNP biosensor（基于PC增强单UCNP生物传感器检测乳腺癌标志物）

将互补于miRNA-155的单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）偶联至配体游离UCNP制探针，以MoS₂纳米片通过π-π堆叠吸附猝灭UCL，靶标miRNA-155与ssDNA杂交使UCNP-ssDNA脱离MoS₂从而恢复UCL。有PC腔（IOPCs/UCNP-ssDNA）与无PC腔（UCNP-ssDNA）体系在miRNA-155浓度1.0 pM–0.6 nM及5 pM–1.5 nM分别呈强线性响应，最低检测浓度达1.0 pM，PC组灵敏度更高；核壳发射比随miRNA浓度呈特征变化；对miRNA-21、miRNA-145、miRNA-182及抗生素无显著响应，具高特异性。

Multiplexed detection of ovarian cancer biomarkers on a microfluidic platform（微流控平台上多元检测卵巢癌生物标志物）

以PDA包裹UCNP（UCNP@PDA）为供体，CA125适配体修饰550 nm吸收峰Au NP（Apt₁₂₅-Au₅₅₀）及HE4适配体修饰650 nm吸收峰Au NP（Apt₄-Au₆₅₀）为双受体，经抗原竞争结合解除FRET猝灭。单通道微流控芯片引入样品，无PC腔传感器CA125线性范围0.025–1.15 U/mL、HE4为0.03–37.5 ng/mL；单@PC腔传感器CA125为0.002–1.8 U/mL、HE4为0.008–85.5 ng/mL，检出限显著降低。两检测通道光谱串扰＜15％；高浓度干扰物（CA15-3、CA19-9、AFP、CEA、PSA、HCG等）响应接近空白，特异性良好。人血清加标回收率CA125为88%–96%（相对标准偏差relative standard deviation, RSD 8.6%–16.9%）、HE4为82%–95%（RSD 3.6%–10.2%）；临床样本检测值与临床参考值吻合，批内RSD平均约11%（CA125）与9%（HE4），证明复杂基质适用性。

四、讨论与结论翻译

综上所述，研究人员成功制备了PC腔与单核壳UCNP复合结构，并通过实验与理论证明可利用光子晶体腔的局域场调制精确控制固定组分单个核壳UCNP的上转换发射颜色。该单颗粒平台相较传统系综检测具有抑制信号平均化、提高信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）及在极低浓度下提升灵敏度的优势。依托此复合体系实现了乳腺癌与卵巢癌相关肿瘤标志物的超灵敏共检；嵌入PC腔的适配体功能化单UCNP凭借独特UCL发射与特异识别性质，可同时特异地检测双通道卵巢癌肿瘤标志物，且该微流控器件对乳腺癌miRNA-155等标志物展现优异通用性与检测性能。本研究不仅为单UCNP操控提供了新策略，也为各类肿瘤标志物高灵敏度多通道检测开辟了新机遇。