通过水稻全基因组重测序发现单核苷酸多态性并开发具有不同直链淀粉含量的马来西亚水稻种质的分子标记

《Discover Plants》：Discovery of single nucleotide polymorphisms via rice whole-genome resequencing and development of molecular markers in Malaysian rice accessions with varying amylose contents

　　

水稻直链淀粉含量（Amylose Content, AC）是决定稻米品质的关键因素，影响蒸煮、食用及饮食偏好，而这些偏好在亚洲各地存在差异。水稻育种计划面临的主要挑战是培育符合这些多样化消费者偏好的水稻品种。尽管单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）标记已成为通过标记辅助育种（Marker-Assisted Breeding, MAB）和标记辅助选择（Marker-Assisted Selection, MAS）改良水稻性状的有力工具，但与马来西亚水稻种质AC相关的SNP标记在很大程度上仍未得到探索，这限制了针对AC性状的育种工作的精确性和效率。为填补这一空白，研究人员对13个水稻品种进行了全基因组重测序，在淀粉生物合成基因（Starch Biosynthetic Genes, SBGs）中鉴定出902个SNP。随后，研究人员利用MassARRAY iPLEX?平台开发了66个SNP标记，并在155份马来西亚水稻种质中进行了实验验证。经过SNP质量控制，保留了59个SNP，基因分型成功率达到89.4%。鉴定出的SNP在种质间表现出中等程度的多样性，多态性信息含量（Polymorphic Information Content, PIC）值在0.05至0.37之间，总体平均值为0.26。功能注释强调了Wx、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase, AGPase）、淀粉合酶IIIa（Starch Synthase IIIa, SSIIIa）和淀粉磷酸化酶（Starch Phosphorylase, SPho）中的六个有害SNP。利用一般线性模型（General Linear Model, GLM），研究人员在Wx位点内鉴定出两个SNP，它们在不同水稻种质的低和高AC水平之间表现出显著关联。本研究为AC性状的分子育种提供了有价值的SNP标记，解决了目前在开发满足马来西亚及其他地区消费者偏好的水稻品种方面的局限性。

研究背景与意义

稻米是全球重要的粮食作物，其烹饪、食用和饮食偏好因地区而异。东南亚国家如马来西亚、菲律宾、越南和印度尼西亚偏爱中等直链淀粉含量（AC，20-25%）的水稻，而东亚国家如中国、日本和泰国则更青睐低AC（<20%）的水稻。相反，缅甸和斯里兰卡等国因其较硬的质地和较慢的消化率带来的健康益处（如较低的血糖指数）而偏好高AC（>25%）的水稻。因此，培育具有特定AC特征以满足区域消费者需求的水稻品种至关重要。

然而，目前关于马来西亚水稻种质中与AC相关的SNP标记的研究仍不充分，这限制了针对AC性状育种的精确性和效率。为了应对这一挑战，研究人员开展了此项研究，旨在通过全基因组重测序技术挖掘与AC相关的遗传变异，并开发可用于分子育种的SNP标记，从而加速培育符合消费者需求的水稻新品种。该研究成果发表在《Discover Plants》期刊上。

主要关键技术方法

研究人员采用了多项关键技术方法。首先，选取了13份涵盖糯性、低、中、高四种AC水平的马来西亚水稻品种进行全基因组重测序，测序深度达30×。其次，利用生物信息学工具（如BWA、GATK4、FreeBayes）对测序数据进行比对和SNP识别。随后，研究人员筛选出66个位于淀粉生物合成基因（SBGs）内的高优先级SNP，并利用MassARRAY iPLEX?平台在155份马来西亚水稻种质中进行了基因分型验证。在数据分析阶段，研究人员计算了多态性信息含量（PIC）和固定指数（F_ST）来评估遗传多样性和群体分化。最后，通过一般线性模型（GLM）和混合线性模型（MLM）进行SNP与AC表型的关联分析，并利用SIFT、I-Mutant 2.0和MuPro等工具对有害SNP进行了蛋白功能和稳定性预测。

研究结果

3.1 基因组重测序、读段比对与SNP鉴定

通过对13个马来西亚水稻品种进行全基因组重测序，研究人员获得了约12.2亿条原始双端读段，过滤后得到约12.0亿条高质量读段。将这些读段比对到籼稻品种R498和日本晴（Nipponbare）的参考基因组上，最高比对率为98.87%（MR 297），最低为95.51%（MR 103）。共鉴定出4,699,933个高质量SNP，其中转换（Ts）占71.97%，颠换（Tv）占28.03%，Ts/Tv比率为2.56。SNP在染色体上的分布不均，第1号染色体频率最高，第10号最低。注释结果显示，超过80%的SNP位于基因间区，而在基因区域内，内含子中的SNP（52.86%）多于外显子（47.14%）。值得注意的是，在编码序列（CDS）中，非同义SNP的发生频率高于同义SNP。

3.2 从13个水稻品种的全基因组重测序中鉴定淀粉生物合成基因（SBGs）中的SNP

在29个SBGs中共鉴定出902个SNP。其中，淀粉合酶（SS）类基因中的SNP数量最多（329个），其次是淀粉分支酶（SBE）（224个）和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）（147个），而葡萄糖-6-磷酸转运蛋白（GPT1）和淀粉磷酸化酶（SPho）中的SNP数量最少。在不同AC类别的品种中，共鉴定出119个独特的SNP，其中糯性品种中最多（45个），高AC品种中最少（2个）。基于这119个SNP构建的系统发育树能够将13个水稻品种清晰地分为四个AC类别对应的簇。

3.3 155份马来西亚水稻种质中淀粉生物合成基因的SNP基因分型及SNP功能注释

最初选择了66个SNP标记在Agena MassARRAY iPLEX?平台上进行基因分型。经过质量控制，排除了7个因检出率低和引物设计失败而无法使用的SNP，最终成功对59个SNP（89.4%）进行了基因分型，其中7个（10.6%）在马来西亚水稻种质中为单态。这59个SNP分布在第2、3、4、6、7、8和9号染色体上，其中第6和第9号染色体频率最高，合计占所有验证标记的61%。功能注释在GBSSI、AGPS1、SSIIIa和Pho1等关键酶中鉴定出6个有害的非同义SNP。其中，GBSSI中的Y224S替换、AGPS1中的Y323C替换和GBSSII中的E141G替换位于功能域区域。蛋白稳定性预测显示，GBSSI、GBSSII和SSIIIa中的突变会导致蛋白不稳定，而AGPS1中的Y323C突变则可能增加蛋白稳定性。

3.4 SNP标记效率分析及155份马来西亚水稻种质的遗传关系

59个SNP标记的PIC值范围为0.03至0.37，平均PIC为0.25，表明155份马来西亚水稻种质具有中等程度的多样性。次要等位基因频率（MAF）范围为0.02至0.44，平均为0.23。F_ST分析评估了亚群间的遗传距离，结果显示低AC组（Pop 1）与中间AC组（Pop 2）之间的分化最小（F_ST=0.043），表明它们具有相近的遗传背景。相比之下，糯性AC组（Pop 4）与其他组的分化最大，特别是与Pop 2（F_ST=0.28），表明糯性种质可能拥有独特的淀粉生物合成等位基因。

3.5 SNP与直链淀粉含量的关联分析

基于最大ΔK值，155份马来西亚水稻种质的群体结构被划分为两个簇（K=2）。关联分析显示，在GLM模型中，有16个SNP与AC性状相关，但经Bonferroni校正后，仅有2个SNP（chr06_1766460和chr06_1770009）达到显著水平。而在MLM模型中，校正前有三个SNP（chr06_1766460、chr06_1768006和chr06_1770009）在两个模型中均显示出关联性，但校正后未检测到显著标记。这两个显著的SNP均位于第6号染色体的Wx基因内，其中chr06_1766460位于内含子1，chr06_1770009位于内含子13。chr06_1770009位点的'A'等位基因在高AC种质中的频率为77%，而在低AC种质中为83%的'T'等位基因，这表明该标记可作为筛选高AC栽培品种的有用工具。

讨论与结论总结

讨论部分指出，现代消费者对稻米品质的需求已超越产量，转向了低血糖指数、香气、中等和低直链淀粉含量或抗性淀粉等特定性状。研究人员强调，全基因组重测序是识别DNA多态性的有效手段，本研究中30×的测序深度足以稳健地鉴定出高质量的真实SNP。研究人员还探讨了SNP在基因组中的分布规律，指出转换频率高于颠换是水稻中常见的核苷酸替换模式，且Ts/Tv比率在预期范围内，表明了数据的可靠性。关于SBGs中SNP的基因分型结果，研究人员发现GBSS（尤其是GBSSI）和SS基因中SNP频率较高，这与它们作为淀粉合成关键调节酶的功能相符。此外，对有害SNP的深入计算分析为理解其对蛋白结构和功能的潜在影响提供了重要线索。

结论部分总结道，本研究利用新一代测序和高通量基因分型方法，成功开发出了与低和高AC相关的SNP分子标记。这两个SNP标记为筛选和区分马来西亚水稻种质中的低和高AC提供了强有力的工具。研究还揭示了种质间中等的遗传多样性，以及糯性类型与高AC类型之间存在高度基因组分化。特别值得注意的是，预测会对Wx基因产生有害影响的SNP，是未来利用基因组编辑方法进行功能研究的高优先级目标。总之，本研究生成的全面基因组资源将极大地有益于遗传多样性评估、分子育种计划以及水稻改良的标记辅助选择。