两个液泡质子泵PpVHA-c1和PpVHA-c3促进桃果实中苹果酸积累

《Horticulture Advances》：Two vacuolar proton pumps, PpVHA-c1 and PpVHA-c3, contribute to malate accumulation in peach fruit

　　

苹果酸是决定桃（Prunus persica L.）果实酸度与品质的关键因素。液泡H⁺-ATP酶（VHA）有助于植物中苹果酸的积累，但其在桃果实中的功能仍不明确。本研究在“中油桃14”（CN14）桃基因组中鉴定到23个PpVHA基因，并利用转录组数据对其中3个基因模型进行了人工校正。序列比对与系统发育分析表明，桃中VHA各亚基均至少由1个基因编码。基于苹果酸含量，研究人员筛选出PpVHA-c1和PpVHA-c3作为可能参与苹果酸积累的候选基因。瞬时转基因实验表明，PpVHA-c1和PpVHA-c3均可促进桃果实和本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中的苹果酸积累。此外，研究人员分别预测到9个和14个转录因子作为PpVHA-c1和PpVHA-c3的潜在正调控因子。这些结果表明，PpVHA-c1和PpVHA-c3作为苹果酸积累的正调控因子发挥作用，并为解析桃果实中VHA介导的有机酸代谢调控网络奠定了基础。

该论文发表于《Horticulture Advances》，围绕桃果实酸度形成的分子基础展开，重点解析液泡H⁺-ATP酶（V-ATPase，液泡膜质子泵）家族成员在苹果酸积累中的作用。桃果实风味由糖酸平衡共同决定，其中苹果酸和柠檬酸是主要有机酸，不仅直接影响感官酸度，而且参与细胞pH稳态、渗透调节和代谢调控。已有研究表明，液泡是植物细胞贮存有机酸的主要区室，液泡膜上的质子泵通过建立跨膜质子驱动力，驱动苹果酸等有机酸向液泡内转运和蓄积。然而，尽管VHA在拟南芥、苹果、柑橘等物种中已被证明与有机酸积累密切相关，其在桃中的家族组成、表达特征及关键成员功能仍缺乏系统研究。正因如此，开展桃VHA基因家族的全基因组鉴定及功能解析，对于阐明桃果实酸度形成机制和提升果实品质具有重要意义。

研究人员以“中油桃14”（CN14）基因组为基础，系统鉴定桃VHA基因家族成员，并结合两个桃品种不同发育阶段的转录组数据与苹果酸含量变化，筛选与苹果酸积累相关的候选基因。进一步通过桃果实和本氏烟叶片瞬时过表达及RNA干扰（RNAi）分析，验证候选基因对苹果酸积累的调控作用，同时结合启动子顺式作用元件分析、转录因子预测、表达相关性分析和RT-qPCR验证，挖掘其潜在上游调控因子。研究最终表明，PpVHA-c1和PpVHA-c3是促进桃果实苹果酸积累的正调控因子，为解析桃果实有机酸代谢调控网络提供了重要分子靶标。

本研究主要采用了以下关键技术方法：以拟南芥VHA蛋白序列对CN14桃基因组进行同源比对筛选，并结合保守结构域分析、染色体定位、基因结构校正和系统发育分析完成PpVHA家族注释；利用“Huangshuimi”（HSM）与“Zhongyoutao 14”（CN14）果实S1–S4时期转录组数据和苹果酸测定结果进行表达关联分析；以“Chunmei”（CM）、“Jin Hui”（JH）和“Yumeiren”（YMR）S3期果实及本氏烟材料开展瞬时过表达和RNAi功能验证；结合PlantCARE、PlantRegMap、相关性分析、Cytoscape及RT-qPCR开展候选转录因子预测与验证。

一、Identification and classification of VHA gene members in peach
研究人员利用30条拟南芥VHA序列进行同源筛选，在CN14桃基因组中共鉴定到23个PpVHA基因，对应25条转录本，且均含有保守VHA结构域。基于转录组比对结果，研究人员对基因结构进行了核查，大多数注释保持不变，但有3个基因模型被修订：Ppv2.3G000620（PpVHA-A）和Pp03G032290（PpVHA-d）存在外显子跳跃并形成新的转录本变体，Ppv2.3G004040.1（PpVHA-D）原注释存在提前终止问题。随后通过PCR克隆与测序对修订序列进行了确认。进一步生物信息学分析显示，这些PpVHA蛋白在长度、分子量、等电点和亲疏水性方面存在差异，亚细胞定位预测结果涉及液泡膜、细胞核、质膜、细胞质、线粒体、叶绿体和高尔基体，反映出V-ATPase相关蛋白在植物细胞中具有广泛的功能分布。

二、Phylogenetic analysis of the PpVHA gene family
通过对桃和拟南芥全长VHA蛋白序列进行比对，并构建最大似然系统发育树，研究人员发现桃VHA家族可分为13个进化保守类群。V₁结构域包括A、B、C、D、E、F、G、H八类亚基，V₀结构域包括a、c、c'、d、e五类亚基。结果表明，桃中每一种VHA亚基至少均有1条转录本对应，说明该家族在桃和拟南芥之间具有较强的保守性。该结果不仅明确了桃VHA家族的组成，也为后续功能成员筛选提供了分类基础。

三、Chromosomal distribution patterns of peach VHA genes
基因组定位结果表明，23个PpVHA基因分布于CN14桃的8条染色体上，呈现不均匀分布特征。其中1号和3号染色体上各有5个，6号染色体有4个，8号染色体有3个，4号和5号染色体各有2个，而2号和7号染色体各只有1个。该结果说明PpVHA家族在染色体层面具有明显的分散分布格局，为理解其家族扩张及基因组织特征提供了基础信息。

四、Differential expression patterns of PpVHA genes during peach fruit development
研究人员测定了HSM和CN14两个桃材料果实发育不同阶段的苹果酸含量，发现二者均在S1时期苹果酸含量最高，随后随果实发育逐渐下降。结合25条PpVHA转录本在两个材料S1–S4时期的表达谱分析，发现不同成员呈现明显差异化表达模式。部分基因在CN14早期阶段表达较高，部分在HSM中后期或特定阶段表达。尤其值得注意的是，PpVHA-c1和PpVHA-c3在HSM和CN14中均表现出随发育进程逐渐下调的趋势，且这一变化与苹果酸含量变化呈正相关。基于此，研究人员将其确定为可能参与苹果酸积累的关键候选基因。

五、Functional validation of PpVHA-c1 and PpVHA-c3 in malate accumulation
为验证PpVHA-c1和PpVHA-c3的功能，研究人员在CM和JH桃果实中进行了瞬时过表达实验，并在YMR桃果实中进行了RNAi沉默实验，同时在本氏烟叶片中进行异源瞬时表达。结果显示，在CM和JH果实中过表达PpVHA-c1或PpVHA-c3均可显著提高苹果酸含量；在本氏烟叶片中也观察到一致结果。相反，在YMR果实中瞬时沉默这两个基因会显著降低苹果酸浓度。该部分结果直接证明，PpVHA-c1和PpVHA-c3在桃果实苹果酸积累过程中具有促进作用，是苹果酸积累的正调控因子。

六、Prediction and analysis of cis-acting elements of the PpVHA gene promoter
研究人员对23个PpVHA基因上游2000 bp启动子区域进行顺式作用元件分析，发现其包含光响应、激素响应、分生组织发育、细胞周期调控、低温应答和防御相关元件，提示PpVHA家族可能受到发育信号和环境信号的共同调控。随后，研究人员进一步对PpVHA-c1和PpVHA-c3启动子进行转录因子结合位点预测，分别识别到310个和234个潜在结合位点，对应128个和134个转录因子。结合转录组表达相关性分析，筛选出与PpVHA-c1高度相关的9个、与PpVHA-c3高度相关的14个潜在正调控转录因子，涉及TCP、MYB、bZIP、Dof、NAC、WRKY、HSF、ERF、GATA、MADS和SRS等家族。其中1个NAC转录因子可能同时调控PpVHA-c1和PpVHA-c3。进一步RT-qPCR结果显示，部分候选转录因子与目标基因表达显著正相关，说明这些因子可能参与桃果实苹果酸积累的转录调控。

讨论部分指出，桃果实中苹果酸和柠檬酸是决定酸度与风味的核心有机酸，而液泡作为细胞内最大贮存区室，其酸化能力对有机酸蓄积至关重要。V-ATPase由V₁和V₀两大复合体组成，相关亚基基因在多种植物中均已被报道，但桃中的系统研究此前不足。本研究在桃中识别到23个PpVHA基因，并证明各亚基均至少有1个基因编码，表明其家族结构在植物间总体保守。结合果实发育中的苹果酸变化和表达谱分析，PpVHA-c1与PpVHA-c3被锁定为关键成员；再经瞬时过表达与RNAi实验验证，确认其能够正向调控苹果酸积累。论文还将该结果与苹果、柑橘、梨和欧李中的相关研究进行了对照，说明VHA介导的液泡质子泵活动是果实有机酸积累的共同机制之一。此外，研究还鉴定出多个可能作用于PpVHA-c1和PpVHA-c3的上游转录因子，提示桃果实中VHA表达可能受复杂转录网络调控。整体而言，讨论部分强调了PpVHA-c1和PpVHA-c3在桃果实酸度形成中的关键地位，并将其置于跨物种有机酸代谢调控框架中加以阐释。

研究结论部分可译为：本研究在CN14桃基因组中共鉴定到23个PpVHA基因，并基于系统发育分析将其划分为12个亚群。研究人员利用转录组数据对其基因结构进行了人工校正。基于系统发育关系和序列比对结果，桃中每一种VHA亚基均至少对应1条转录本。在CN14和HSM两个品种中，PpVHA-c1和PpVHA-c3的表达量均随果实发育而下降，提示其可能参与有机酸积累。进一步功能分析表明，PpVHA-c1和PpVHA-c3参与调控桃果实中的苹果酸积累。该研究为理解VHA基因在桃果实有机酸代谢和品质形成中的作用及其调控机制奠定了坚实基础。