《Applied Microbiology and Biotechnology》：Developing an oncolytic Newcastle disease virus production process with EB66 cells
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新城疫病毒（NDV)作为一种潜在的溶瘤性病毒（oncolytic virus, OVC），已在多种癌症类型中受到广泛研究。尽管相关临床研究正在进行中，但大规模生产高剂量NDV仍面临挑战。此前已有文献报道，Vero细胞在悬浮批次培养中可产生2.4×10
新城疫病毒（NDV)作为一种潜在的溶瘤性病毒（oncolytic virus, OVC），已在多种癌症类型中受到广泛研究。尽管相关临床研究正在进行中，但大规模生产高剂量NDV仍面临挑战。此前已有文献报道，Vero细胞在悬浮批次培养中可产生2.4×108 TCID50/mL的病毒滴度。然而，更高输入剂量的需求以及建立Vero细胞高密度培养工艺的困难性，是有效利用这些疗法的重大障碍。为实现更高的工艺强化（process intensification）水平和在高细胞密度下产生病毒载体，EB66细胞已被确定为一种高效的生产细胞系。本研究中，研究人员考察了EB66细胞在NDV生产方面的特性，特别关注批次和半灌流模式下的细胞生长和细胞特异性病毒产率。针对温度、蛋白酶浓度（TrypLE）和感染复数（multiplicity of infection, MOI）等培养参数，确定了批次和半灌流模式下生产NDV的最佳感染条件。随后，将这些有利的生产条件转移至搅拌式生物反应器（stirred tank bioreactor, STR）和轨道振荡生物反应器（orbital shaken bioreactor, OSB）中的不同批次工艺。这些工艺产生了高达4.2×108 TCID50/mL的NDV LaSota株病毒滴度，细胞特异性病毒产率为41 TCID50/细胞。初步半灌流运行实现了65×106 cells/mL的细胞浓度和7.5×108 TCID50/mL的传染性病毒滴度。最后，对生产的病毒进行了效力评估，并证明了NDV注射后小鼠肿瘤体积的缩小。总体而言，这些结果表明EB66细胞可能是生产溶瘤性NDV的可行宿主。
溶瘤性病毒能够选择性裂解癌细胞，而具有完整细胞内防御机制（如干扰素应答）的健康细胞可阻断病毒复制。近几十年来，涉及溶瘤性病毒的全国知名科学研究和临床试验显著增加。一个重要里程碑是欧盟药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）批准了T-VEC（Talimogen Laherparepvec）——一种基于溶瘤性单纯疱疹病毒-1（HSV-1）的皮肤癌治疗药物，这推动了多种病毒疗法的快速发展。然而，许多溶瘤性病毒的生产和制造仍具挑战性。以T-VEC为例，推荐剂量为首次应用10
6 PFU/mL，后续剂量为10
8 PFU/mL，每剂最大体积为4 mL。其他疗法可能需要超过10
10个感染性病毒的更高输入剂量。因此，必须通过筛选合适的生产细胞系和符合相关监管及GMP标准的最佳生产条件，对生产工艺进行高度优化。
除HSV-1外，多种溶瘤性病毒已被文献记载，包括水疱性口炎病毒（VSV)、麻疹病毒（MV)和新城疫病毒（NDV)。NDV在新生小鼠中的溶瘤活性于20世纪50年代首次被发现。自20世纪90年代以来，已开展超过10项以NDV作为黑色素瘤、结直肠癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌等多种癌症治疗药物的临床研究，显示出良好的安全性，未发生严重不良事件，并显著提高了总生存率。目前，弱毒型NDV LaSota株作为溶瘤剂和兽用疫苗的生产主要依赖鸡胚。然而，鸡胚生产存在诸多局限，包括难以规模化、效率较低、胚间差异、污染废弃物、供应链困难等问题。
根据毒株毒力不同，NDV可引起禽类严重疾病甚至死亡，但对人类无致病性。NDV是一种包膜病毒，大小约100至200 nm，编码六种不同蛋白（F、HA、N、M、L、P）。P蛋白序列可替代翻译为V和W蛋白。V蛋白在禽细胞感染中起关键作用，作为I型干扰素（IFN I）拮抗剂抑制细胞对病原体的内在应答，但V蛋白仅拮抗禽类IFN I而非人类IFN I。癌细胞在干扰素通路存在缺陷以实现无限生长，这也影响了细胞对病原体的应答。研究表明，NDV在癌细胞中的复制率比正常人类细胞高约10,000倍。中强毒型和强毒型NDV在禽类中致病性最高，因此在临床研究中很少使用；弱毒型株如LaSota株则更受青睐。然而，弱毒型株的融合蛋白需要切割才能感染，因此生产过程中需添加蛋白酶（如TrypLE）。
本研究旨在评估禽类EB66悬浮细胞（Valneva SE）生产溶瘤性LaSota NDV株的可行性。EB66细胞来源于北京鸭胚胎干细胞，无内源性逆转录病毒，倍增时间短（12至15小时），在灌流模式下可达1.6×10
8 cells/mL的高细胞密度。EB66细胞可在较低起始浓度下接种，与其他连续细胞系相比，谷氨酰胺消耗量低，乳酸和铵离子积累少。目前EB66细胞已用于9种获批疫苗的生产，学术研究也报道了黄热病毒和寨卡病毒在其中的高产率培养。
研究人员首先考察了EB66细胞的生长特性。批次培养中，EB66细胞在0.3×10
6 cells/mL接种后3天内达到6.0×10
6 cells/mL，倍增时间为15.0小时，最大细胞浓度为12.0×10
6 cells/mL，最大比生长速率（μ
max）为0.036 h
-1。半灌流模式下，细胞峰值达65.0×10
6 cells/mL，μ
max降低16%至0.030 h
-1，倍增时间为23.1小时。在细胞浓度超过50.0×10
6 cells/mL时，EB66细胞倾向于形成聚集体，影响细胞计数准确性。
针对最佳感染条件的小规模筛选，研究人员测试了温度、MOI和TrypLE浓度的影响。温度降低至33°C时，最大活细胞浓度比37°C低16%，但从48小时感染后起，病毒滴度平均差异≥1个对数单位，33°C时细胞活力和病毒滴度明显更高。不同MOI（10
-2至10
-5）的批次培养显示相似结果，最大病毒滴度为1.0–2.0×10
8 TCID
50/mL；MOI 10
-5达峰时间延迟12小时。TrypLE浓度测试表明，5.0 U/mL、7.5 U/mL和5.0 U/(mL×day)的批次添加导致最低的最大病毒滴度（1–2×10
8 TCID
50/mL）；而1.0 U/mL、2.5 U/mL和1.0 U/(mL×day)条件获得最高病毒滴度，可达4.5×10
8 TCID
50/mL。当在高细胞浓度下测试时，观察到细胞密度效应导致生产力降低。半灌流模式下，2.5 U/mL TrypLE和MOI 10
-4条件获得最高滴度7.5×10
8 TCID
50/mL，细胞特异性病毒产率（CSVY）为20，此条件被选用于后续实验。
生物反应器培养中，研究人员比较了不同搅拌速度（100 rpm、150 rpm、200 rpm、250 rpm）的影响。100 rpm和250 rpm下EB66细胞生长受阻，未能超过1.0×106 cells/mL。150 rpm和200 rpm条件下，最大细胞浓度分别为10.4×106和9.4×106 cells/mL；200 rpm时在60–72小时感染后出现VCC急剧下降65%，而150 rpm条件下45%的下降发生在12小时后。感染性病毒滴度在84小时感染后达到峰值，200 rpm时为1.7×108 TCID50/mL，150 rpm时为4.2×108 TCID50/mL，CSVY分别为38和41。轨道振荡生物反应器（OSB）培养中，μmax提高至0.044 h-1，最大细胞浓度达12.0×106 cells/mL，但CSVY略低（26 TCID50/cell），最大感染性病毒滴度与搅拌式生物反应器相似（3.2–4.2×108 TCID50/mL）。各培养容器的感染性病毒滴度、CSVY和体积产率（VVP）结果相似。
效力评估方面，研究人员采用MTT法检测了EB66细胞生产的NDV对HeLa、HepG2和A549三种肿瘤细胞的杀伤效果。MOI为10-3时，所有细胞系细胞活力与PBS对照组无区别；MOI为10-1时，A549细胞活力降低；MOI为10时，HeLa细胞完全裂解，HepG2细胞活力低下，EB66来源的NDV毒性低10%但差异不显著，A549细胞活力降低且与NDV来源无关。体内试验中，B16-F10黑色素瘤模型小鼠经多次瘤内注射EB66细胞生产的NDV（每次107.5 TCID50）后，所有小鼠存活至实验结束（45天），而PBS对照组小鼠在19–21天间全部死亡。NDV治疗组最大平均肿瘤体积仅0.13 cm3（第31天），之后未观察到肿瘤；PBS组平均肿瘤体积高达2.29 cm3。第19天时，NDV组肿瘤显著小于对照组（p=0.003），且总生存期更长。
本研究确定了EB66细胞生产溶瘤性NDV的最佳感染条件：MOI 10-4、TrypLE 2.5 U/mL单次添加、感染时温度降至33°C。这些条件在半灌流模式的高细胞密度培养中得到验证。EB66细胞生产的溶瘤性NDV保留了其效力，与鸡胚来源材料相比，溶瘤效果无显著差异。生产工艺成功转移至实验室规模的搅拌式生物反应器和轨道振荡生物反应器，批次模式峰值感染性病毒滴度达4.2×108 TCID50/mL，半灌流模式达7.5×108 TCID50/mL，证明EB66细胞系是溶瘤性NDV生产的合适宿主。下一步可开发带连续病毒收获的灌流工艺，以实现超过1×109 TCID50/mL的目标滴度。
该论文发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》。主要关键技术方法包括：采用EB66悬浮细胞系进行批次和半灌流培养；使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的NDV LaSota重组病毒，通过反向遗传学拯救；利用ViCell XR细胞计数仪测定活细胞浓度和活力，Cedex分析仪检测代谢物（葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、氨）浓度；TCID50法测定感染性病毒滴度；通过MTT细胞增殖/毒性试验评估体外溶瘤效力；建立B16-F10黑色素瘤C57/Bl6小鼠模型进行体内效力验证。
