《Applied Microbiology and Biotechnology》：Engineering of ω-transaminases for advanced applications
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ω-转氨酶（ω-TAs）是手性胺不对称合成中成熟的生物催化剂，但其广泛应用仍受限于催化活性、底物谱、不对称合成中的平衡约束及工艺兼容性（如有机溶剂耐受性）等问题。近年来，相关研究已从单纯的酶挖掘转向针对性开发策略以解决上述局限。本综述系统总结了ω-转氨酶开发的
ω-转氨酶（ω-TAs）是手性胺不对称合成中成熟的生物催化剂，但其广泛应用仍受限于催化活性、底物谱、不对称合成中的平衡约束及工艺兼容性（如有机溶剂耐受性）等问题。近年来，相关研究已从单纯的酶挖掘转向针对性开发策略以解决上述局限。本综述系统总结了ω-转氨酶开发的最新进展，重点关注蛋白工程与工艺层面的优化。基于结构的半理性诱变策略持续提供稳健的渐进式性能提升，而多位点活性导向的工程化改造已被证实对β-和γ-氨基酸或位阻较大的胺类等难转化底物具有显著效果。新兴的人工智能与AlphaFold辅助工作流正逐步通过降低实验成本推动理性酶设计的发展。除酶序列优化外，反应工程、多酶级联及工艺强化策略在提升整体性能与可放大性方面发挥着关键作用。基因组挖掘与酶资源发现工作作为拓展ω-转氨酶工具箱的支撑手段也在文中进行了简要讨论。总体而言，近年来的研究表明，成功的ω-转氨酶开发越来越依赖于酶工程与智能工艺设计的集成策略，而非孤立的单一优化路径。
ω-转氨酶（ω-TAs）是手性胺不对称合成的核心生物催化剂，这类化合物是制药、农化和精细化工领域的关键结构单元。其可在温和条件下立体选择性地将氨基从胺供体转移至前手性酮或醛，因此成为传统化学胺化方法的重要替代方案。过去二十年的大量筛选与蛋白工程研究已获得众多具有多样底物谱与优异立体偏好性的ω-转氨酶，对映体过量值通常大于99%，使其成为工业生物催化中相对成熟的酶类。然而该酶仍存在固有局限：对大位阻或非天然底物的活性有限（西他列汀是典型代表）、不对称合成的反应平衡不利、底物或产物抑制、酶稳定性不足、有机溶剂耐受性差及辅因子依赖等问题。因此近年研究重点已从简单酶挖掘转向更复杂的开发策略，融合蛋白工程、计算工具与工艺优化，目标不再局限于发现新ω-转氨酶，而是提升催化性能、拓展底物谱并将该酶整合至高效可放大的反应体系中。
蛋白工程策略是ω-转氨酶开发的核心。基于结构的半理性活性位点工程是当前应用最广的性能提升方法。随着晶体结构数量的增长（2010年69486个，2025年247280个）及高质量结构预测技术的发展，研究人员可通过靶向突变重塑活性位点、调控底物结合口袋或影响通向催化中心的通道。研究显示少量理性选择的突变即可带来可测量的活性提升：例如S. thermophilus来源的ω-转氨酶S17P|T38V突变体活性较野生型提高10.5倍；Salmonella enterica来源酶的突变体活性提升达31倍。这类策略还可改善底物接纳能力，通过扩大或重塑ω-转氨酶特征性的“大”“小”结合口袋，拓展细菌ω-转氨酶对大位阻酮或杂环化合物的底物谱。此类改进主要源于底物容纳能力的增强而非催化机制的根本改变，虽多为渐进式增益，但稳定性与可靠性优势使其特别适用于工业场景。结合同源建模或AlphaFold结构、分子对接与有限突变筛选的研究模式，体现了现代结构工具如何在不依赖 exhaustive 定向进化的情况下简化半理性酶优化流程。
多位点突变与活性导向优化则超越单点或口袋靶向干预，重点关注催化活性或严苛条件下的稳定性提升。与严格结构导向策略不同，这类研究更侧重实验筛选与性能指标而非详细机制解析。代表性案例包括对Sphaerobacter thermophilus耐热ω-转氨酶的系统改造，通过对活性位点及周边的多位点突变，在维持大于99%对映体过量的同时实现反应速率的大幅提升（比活力较野生型最高提高10.5倍），且突变组合表现出累加或协同效应，凸显了探索孤立单点突变之外的序列空间的价值。另一项研究实现了Bacillus megaterium来源ω-转氨酶比活力3.7倍的提升及45℃下半衰期19.9倍的延长。这类活性导向策略对β-氨基酸、大位阻胺等天然ω-转氨酶仅表现边缘活性的难转化底物尤为有效，证明经典蛋白工程仍是实用的开发工具。
人工智能与AlphaFold辅助酶设计正逐步影响工程策略。AlphaFold的广泛应用大幅降低了基于结构设计的技术门槛，即使缺乏实验晶体结构也可实现理性突变选择——截至2026年2月13日，RCSB数据库包含248942个实验结构与999251个AlphaFold预测结构，凸显计算建模的重要性。多项研究将AlphaFold模型与分子对接、有限分子动力学模拟结合指导诱变，通过预测酶-底物相互作用识别可能影响底物结合、通道几何结构或辅因子定位的残基，后续定点突变证实这类计算指导的干预可有效提升催化活性与底物谱。但目前AI辅助设计的贡献仍以渐进式改进为主，提升幅度常与经典半理性策略相当，且多数研究仍需实验筛选验证预测结果，说明当前AI工具主要作为决策支持系统而非自主设计引擎。随着计算方法成熟与训练数据集扩展，这类工作流有望进一步补充传统蛋白工程策略，尤其在降低实验成本与缩小突变搜索空间方面潜力显著。
机器学习驱动优化是突破传统定向进化局限的变革性策略。数据获取与特征工程是核心瓶颈，结合理性设计与机器学习的方案可显著提升模型性能，例如通过结构引导诱变构建的胺转氨酶变异体文库可为预测模型提供高质量训练集。特征编码采用多种策略：理化描述符用于表征底物与特定位点氨基酸残基的电子与空间性质；数字序列编码利用快速傅里叶变换与AAindex数据捕捉蛋白质序列的局部与长程相互作用；热力学特征将结合能变化（ΔΔG）纳入特征以提升酶-底物复合物稳定性与亲和力的预测精度。算法层面，梯度提升回归树模型在催化活性预测中表现最优，相关系数R2可达0.905，随机森林与LightGBM等集成方法也能稳健处理蛋白质序列与功能输出的非线性关系。迁移学习是最具前景的方向之一，研究表明在一个酶上训练的模型可通过“蛋白指示剂”或共享描述符以极少额外数据适配其他相关蛋白，预示机器学习模型有望发展为跨酶家族的通用工具。
对工程范式的关键评估揭示了不同策略的权衡：传统结构导向理性设计仍是拓展ω-转氨酶对大位阻酮或杂环化合物底物谱的金标准，但这类干预常过度聚焦底物容纳，可能牺牲全局蛋白稳定性或其他性状的可进化性；而多位点与数据驱动策略（含机器学习与序列引导重设计）在同步优化活性与操作稳定性方面成功率更高，说明考虑更广阔的序列-功能景观而非仅关注活性位点本身，对开发工业级稳健生物催化剂至关重要。当前AI与AlphaFold工作流的影响仍以支持性和渐进性为主，核心瓶颈是高品质训练数据的稀缺——尤其是代表失败突变的负向数据不足，限制了机器学习模型在无大量实验验证下自主设计“超级酶”的能力，因此这类工具更适合作为决策辅助而非完全自主的设计平台。
除酶序列优化外，工艺层面的优化同样关键。反应工程与平衡控制是解决ω-转氨酶不对称合成热力学平衡不利的核心，策略包括选择胺供体、共产物移除（如通过丙酮酸脱羧酶移除丙酮酸）、溶剂体系优化等。近期应用研究显示，即使使用未修饰酶，通过精细调控供体浓度、pH、温度与共溶剂组成也可大幅提升转化率。更具创新性的是“智能”胺供体的应用：例如以L-赖氨酸为供体时，副产物可自发环化从反应体系移除；异丙胺脱氨生成的丙酮可通过低压移除；深共熔溶剂作为替代反应介质可同时提升难溶底物溶解度与酶活性。这些进展表明仅靠酶工程往往不足以实现高时空产率与工业级底物负载，适度工程化的ω-转氨酶可通过合理的反应设计实现高效催化。
多酶级联与系统集成进一步突破平衡限制并拓展合成可能性。ω-转氨酶越来越多地被嵌入多酶级联反应中，通过与上游或下游酶促转化的偶联实现高效的底物通道效应与反应组分连续再生。近期案例包括将生物质衍生中间体转化为功能化胺的 chemozymatic 与全酶级联体系，其中ω-转氨酶承担关键立体选择性步骤，辅助酶驱动反应完成。这种视角转变将ω-转氨酶从孤立催化剂重新定义为大型合成网络中的模块化组件，使现有酶可在无需极端蛋白工程的前提下应用于高难度转化。
工艺强化与连续概念正在获得更多关注，包括膜辅助产物移除、连续流操作与酶固定化等策略，旨在提升生产率、稳定性与可放大性。典型案例是将ω-转氨酶催化与聚丙烯膜分离技术集成用于(R)-2-氟-α-甲基苄胺的不对称合成，实现抑制产物的连续移除与平衡调控优化。这类概念证明工艺工程可直接弥补酶的内在局限性，为深度蛋白改造提供替代或补充路径，尽管目前仍多处于实验室规模，但已指向未来连续或半连续操作的工业应用场景。
基因组挖掘与工具箱拓展作为支撑性工作持续推进，通过全基因组筛选不断扩充ω-转氨酶的已知库，提供序列多样性。但这类发现导向研究的即时影响有限，多数新鉴定酶仅表现中等活性，仍需后续工程改造才能实用，因此当前主要作为下游开发的原料供给手段，而非独立创新驱动因素。最后需指出，工业级应用对生物催化剂生产率有明确阈值要求（每克酶生产20–50克产物），当前实验室成果在转化率上已接近95%的目标（最高达90%），但底物负载量（最高60 mM）仍远低于大于200 mM的工业需求。将优化后的酶作为全细胞催化剂整合至连续反应系统是极具潜力的达标路径，但也需克服生物膜形成导致的堵塞、传质阻力等新挑战。
