《GeroScience》：Age and sex dependent shift in murine gut microbiome reveals pathological links to host cardiovascular and metabolic pathways
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摘要：肠道微生物组( gut microbiome )于全生命周期中发生动态的、依赖性别的改变。然而，综合考察年龄与性别联合效应的研究仍较有限。本研究采用16S rRNA基因(V3–V5区)测序，结合QIIME2及PICRUSt2进行微生物群落结构与预测功能谱
摘要：肠道微生物组( gut microbiome )于全生命周期中发生动态的、依赖性别的改变。然而，综合考察年龄与性别联合效应的研究仍较有限。本研究采用16S rRNA基因(V3–V5区)测序，结合QIIME2及PICRUSt2进行微生物群落结构与预测功能谱分析，并以MetaCyc数据库进行通路注释，探讨年轻(4个月，n=14)与老年(20个月，n=20)C57BL/6J小鼠雌雄两性的肠道微生物组组成与功能改变。与老年小鼠相比，年轻小鼠α多样性( alpha diversity )更高，其中年轻雌鼠升高最为显著；该性别特异性差异在老年小鼠中消失。衰老伴随厚壁菌门( Firmicutes )与拟杆菌门( Bacteroidetes )比值( F/B ratio )升高，以及关键类群的改变——乳酸杆菌属( Lactobacillus )和罗氏菌属( Roseburia )增加，拟杆菌属( Bacteroides )和毛螺科( Lachnospiraceae )减少。功能预测显示显著的衰老相关代谢偏移，雌鼠尤为明显，45条通路发生改变，包括支链氨基酸( branched-chain amino acid, BCAA )代谢、尿酸( uric acid )代谢及脂多糖( lipopolysaccharide, LPS )生物合成通路上调。为直接关联微生物BCAA代谢与宿主代谢结局，研究人员定量了粪便中细菌BCAA氨基转移酶基因( ilvE )丰度，发现老年小鼠显著升高；同时老年小鼠血浆BCAA、胰岛素及随机血糖升高，提示衰老相关代谢失调。老年小鼠粪便ilvE丰度与血浆BCAA水平呈正相关，与血糖呈负相关，提示微生物BCAA代谢与宿主葡萄糖稳态( glucose homeostasis )相关。研究结果表明肠道微生物组组成与功能受年龄和性别共同影响，且微生物BCAA代谢改变与衰老过程中宿主代谢参数相关联，强调在微生物组研究中将年龄与性别作为生物学变量的重要性，并为开发年龄与性别特异性的微生物组靶向干预提供依据。
论文解读：《Age and sex dependent shift in murine gut microbiome reveals pathological links to host cardiovascular and metabolic pathways》
研究背景与意义
肠道微生物组通过调节代谢、免疫功能及肠屏障完整性在宿主健康中发挥关键作用。肠道微生态失衡（dysbiosis）与炎症性疾病、肥胖及神经退行性疾病相关。年龄与性别是塑造肠道微生物组的关键生物学变量，但二者单独及联合效应在健康状态下的研究尚不充分——人类研究常受合并症、生活方式等混杂因素干扰，难以区分年龄与性别的独立及交互作用。已有报道提示年轻成人中性别依赖性微生物差异较明显而中年减弱，但年龄—性别交互如何影响微生物功能通路及其与宿主代谢（特别是心血管与代谢疾病风险）的联系尚不明确。本研究利用无合并症干扰的健康C57BL/6J小鼠模型，建立不同年龄与性别的肠道微生物组基线谱，阐明年龄—性别依赖的菌群组成与功能改变，并验证微生物支链氨基酸（branched-chain amino acid, BCAA）合成潜力与宿主代谢参数的关联，为理解微生物组在衰老及相关代谢性疾病中的作用提供依据。本文发表于《GeroScience》。
主要关键技术方法
研究人员采集年轻（4月龄）与老年（20月龄）C57BL/6J小鼠雌雄各半的盲肠（cecum）内容物（年轻n=14，老年n=20，雌雄均衡）。主要实验方法包括：（1）微生物DNA提取后行16S rRNA基因V3–V5区Illumina MiSeq测序，经DADA2流程获得扩增子序列变体（Amplicon Sequence Variant, ASV）并使用SILVA数据库进行分类学注释，计算α多样性（Shannon、Chao1指数）与β多样性（Bray–Curtis相异度、加权/非加权UniFrac距离），通过PCoA及PERMANOVA分析组间差异，LEfSe鉴定差异丰度菌属；（2）基于Greengenes数据库，以PICRUSt2预测微生物功能谱并映射至MetaCyc通路，STAMP进行通路水平统计检验（Welch's t-test，FDR校正）；（3）qPCR定量粪便微生物ilvE（编码BCAA氨基转移酶）基因相对16S rRNA基因丰度；（4）ELISA测定血浆胰岛素，比色法测定血浆BCAA，尾血血糖仪测随机血糖；（5）非参数统计（Kruskal–Wallis、Wilcoxon秩和、PERMANOVA、Spearman/Pearson相关）进行组间比较与相关分析。
研究结果
Young female mice exhibit the largest gut microbial alpha diversity
年轻小鼠α多样性（Chao1及Shannon指数）显著高于老年小鼠；雌性整体高于雄性，其中年轻雌鼠多样性最高，年轻雄鼠次之但显著低于年轻雌鼠；老年小鼠雌雄间差异消失，提示衰老使微生物多样性下降并消除性别差异。
Age associated dispersion of gut microbial communities is more pronounced in older males
PCoA显示年轻与老年小鼠微生物群落结构显著分离（PERMANOVA p=0.001），年龄效应强于性别效应。年轻雌雄有轻微分簇，老年雄鼠较老年雌鼠偏离年轻簇更远，提示衰老尤其是雄性肠道菌群β多样性离散度更大。
Aging increases firmicutes to bacteroidetes ratio in the gut microbiome
衰老小鼠厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度升高（尤以Bacilli和Mollicutes为主，Lactobacillus、Roseburia增多），拟杆菌门（Bacteroidetes）及毛螺科（Lachnospiraceae）、拟杆菌属（Bacteroides）减少，Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值升高。雄性整体F/B比高于雌性。
Age-associated gut microbiome shifts at different taxonomic level reveal sex-specific dysbiosis
除Firmicutes升高、Bacteroidetes降低见于两性老年鼠外，变形菌门（Proteobacteria）在年轻雌鼠较高；Patescibacteria与柔膜菌门（Tenericutes）在老年雄鼠富集；毛螺科（Lachnospiraceae）在年轻雌鼠较高；乳酸杆菌属（Lactobacillus）老年两性均升高，罗氏菌属（Roseburia）与普雷沃氏菌属（Prevotella）在老年雄鼠升高，提示性别特异性菌群重塑。
Functional profiling of the aging gut microbiome reveals significant upregulation of branched-chain amino acid, uric acid, and lipopolysaccharide pathways in older mice
PICRUSt2预测显示老年鼠48条MetaCyc通路显著改变，BCAA代谢（L-缬氨酸降解I、L-亮氨酸降解I等）、尿酸代谢（腺苷核苷酸降解IV等）及CMP-legionaminate（LPS相关）生物合成通路上调；异源发酵及双歧杆菌支路（短链脂肪酸short-chain fatty acid, SCFA相关）下调。
Aged females but not aged males show metabolic pathway shifts in the gut microbiome
雌雄整体功能差异极小（仅2条钴胺素合成通路在雄性略高）。但老年雌鼠vs年轻雌鼠有45条通路显著差异——发酵、脂肪酸β-氧化、BCAA降解、辅因子/维生素合成、泛醇（ubiquinol）合成、糖原降解及三羧酸循环（tricarboxylic acid, TCA cycle）上调；类异戊二烯（geranylgeranyl diphosphate及甲羟戊酸mevalonate途径）下调，提示雌鼠年龄相关功能重塑更显著。
Age dependent alterations in gut microbiome metabolic pathways are linked to host health
上述通路改变预测老年鼠心血管疾病、炎症、肾脏、代谢及神经退行性疾病风险增加。
Association between gut microbial BCAA metabolism and host metabolic parameters
老年小鼠粪便细菌ilvE基因（BCAA aminotransferase）相对丰度显著高于年轻小鼠。老年鼠血浆BCAA、胰岛素、随机血糖均高于年轻鼠。老年鼠粪便ilvE丰度与血浆BCAA正相关（r=0.65），与随机血糖负相关（r=-0.89）；血浆BCAA与血糖负相关。血浆胰岛素与各指标无显著相关，提示存在不依赖于经典胰岛素信号通路的代谢改变。
讨论与结论总结
研究人员发现：（1）年轻雌鼠盲肠内容物微生物α多样性最高，衰老使其下降并使性别差异消失；（2）衰老引起Firmicutes升高、Bacteroidetes降低（尤老雄明显），β多样性改变反映老年菌群恢复力下降；（3）功能预测示老年鼠BCAA、尿酸及LPS生物合成通路上调（雌鼠变化更显著），异戊二烯及部分SCFA相关通路下调；（4）粪便微生物ilvE基因丰度在老年鼠升高且与血浆BCAA正相关、与血糖负相关，支持微生物BCAA合成能力与宿主循环中BCAA水平及葡萄糖稳态相关联，且该关联不依赖胰岛素。研究确立健康小鼠年龄—性别依赖的肠道微生物组与功能基线，强调应将年龄与性别作为微生物组研究的生物学变量，为年龄与性别特异性的微生物组靶向干预提供理论基础。
结论（原文凝练翻译）：本研究全面分析了年轻与老年C57BL/6J小鼠雌雄两性肠道微生物组的多样性、组成及功能潜能的年龄—性别差异。衰老伴随α多样性降低、门水平改变（Firmicutes/Bacteroidetes比值升高）及微生物代谢通路改变，雌鼠表现出更显著的衰老相关微生物破坏。功能预测提示老年鼠氨基酸代谢（含BCAA）、尿酸代谢及糖原分解活性增强，微生物BCAA代谢潜能与宿主代谢参数相关联，暗示微生物对衰老期代谢失调的潜在贡献。明确健康小鼠这些基线变化及其与宿主代谢的关联，为解读疾病相关微生物组改变及探究微生物组在年龄相关疾患与性别差异中的作用提供了重要依据。
