类风湿关节炎中的免疫失衡：基于γδ T细胞受体表型分析的见解

《Human Cell》：Immune imbalance in rheumatoid arthritis: insights from γδ T cell receptor phenotyping

　　

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种以持续性滑膜炎症和进行性关节破坏为特征的慢性自身免疫性疾病。尽管传统αβ T细胞已被广泛研究，但γδ T细胞在RA发病机制中的作用仍未得到充分阐明。与αβ T细胞不同，γδ T细胞能够在不依赖主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制的情况下识别抗原，其表面受体表达在调控效应功能方面发挥关键作用。本研究旨在考察接受抗肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）治疗的RA患者γδ T细胞的表型及表面受体谱，以更好理解其潜在的免疫调节意义和预后意义。研究人员于TNF抑制剂治疗前及治疗过程中收集RA患者外周血样本，并纳入健康对照。采用流式细胞术（flow cytometry）定量γδ T细胞频率，并评估其表面所选活化、分化及耗竭标志物的表达。结果显示，与健康对照相比，RA患者循环γδ T细胞频率显著降低。此外，RA中的γδ T细胞呈现晚期分化和功能耗竭的表型特征，包括关键表面受体表达发生改变。所观察到的γδ T细胞表型及受体表达改变提示RA中存在慢性免疫激活。这些发现凸显了γδ T细胞表面标志物作为疾病活动度及抗TNF治疗应答候选生物标志物的潜力。

该文发表于《Human Cell》，围绕类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）中γδ T细胞（兼具先天样与适应性免疫特征的非常规T淋巴细胞）的免疫学异常展开，重点分析其在抗肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）生物制剂治疗背景下的表型重塑及临床关联。RA是一种慢性自身免疫病，其核心病理过程包括持续性滑膜炎症、软骨与骨破坏及最终功能残疾。既往研究对αβ T细胞的认识较为充分，但γδ T细胞由于不依赖主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）进行抗原识别，并且表达多种与自然杀伤细胞（natural killer，NK）共享的受体，因此在炎症调控、细胞毒作用和免疫稳态维持中的特殊作用日益受到关注。尽管已有研究提示RA患者外周血和滑膜中γδ T细胞水平异常，并与疾病活动度存在一定关系，但其不同受体谱、分化状态、耗竭特征及与抗TNF疗效之间的联系仍不清楚。因此，开展本研究具有明确必要性：一方面可补充RA免疫发病机制中非常规T细胞层面的证据，另一方面有望为疾病监测和疗效预测提供新的细胞学标志物。

研究人员纳入34例符合2010年欧洲抗风湿病联盟（European League Against Rheumatism，EULAR）分类标准的RA患者，并于抗TNF治疗基线、治疗3个月和6个月进行连续评估，同时设置44名健康对照。研究结果显示，RA患者外周血γδ T细胞比例显著下降，且在总事件数中的绝对计数也明显少于健康对照，提示该细胞群在RA中存在数量学缺陷。进一步表型分析表明，RA患者γδ T细胞更倾向于终末分化效应表型，即CD45RA⁺CD27^? TEMRA（terminally differentiated effector memory RA）细胞比例升高，而CD45RA^?CD27⁺ TCM（central memory）细胞比例下降，反映出其由较低分化状态向高度分化、细胞毒性增强且增殖潜能受限的方向偏移。结合CD56、CD16及CD45RA等指标升高，研究支持RA中γδ T细胞处于慢性激活后向细胞毒与耗竭并存状态演进的结论。

在受体层面，研究显示RA患者γδ T细胞活化性受体表达整体下降，而抑制性受体表达增强。具体而言，CD28、DNAM-1（CD226）等活化/共刺激受体在表达细胞比例及荧光强度上均低于健康对照，提示γδ T细胞的效应激活潜能下降；相反，TIGIT、PD-1（CD279）及TIM-3（CD366）等抑制性受体上调，支持其处于功能耗竭状态。尤其TIGIT在细胞比例和中位荧光强度（median fluorescence intensity，MFI）上均表现出较为突出的差异，提示其可能是较有价值的候选标志物。相关性分析进一步揭示，在治疗前RA患者中，活化性受体与CD56、CD16、CD45RA等细胞毒/成熟相关标志物呈负相关，而抑制性受体与CD45RA、CD16呈正相关，这说明随着γδ T细胞向高度分化和耗竭状态推进，其活化驱动逐渐减弱，抑制性调控逐渐增强。相比之下，健康对照中的此类相关性较弱，提示RA中的γδ T细胞网络已发生异常重构。

文章还探讨了γδ T细胞变化与抗TNF疗效之间的关联。研究发现，在治疗6个月后疗效较差的患者中，γδ T细胞比例及TCRγδ表达强度存在下降趋势，虽然未达到统计学显著，但提示γδ T细胞减少及受体信号减弱可能与较差治疗应答相关。临床参数相关性分析显示，总体γδ T细胞及Vδ2亚群多与炎症活动参数呈负相关，而Vδ1亚群则更倾向于正相关；同时，活化受体与临床不良参数多呈负相关，抑制受体则多呈正相关，说明γδ T细胞状态与疾病活动度之间存在方向一致的联系。ROC分析进一步显示，γδ T细胞及其受体参数具有一定区分良好应答者的能力，其中TIGIT⁺ γδ T细胞、CD56⁺ γδ T细胞、DNAM-1⁺ γδ T细胞和CD28⁺ γδ T细胞的判别表现相对突出，提示这些指标可能用于辅助治疗分层。

本研究的意义主要体现在三个方面。首先，研究较系统地描绘了RA患者γδ T细胞在数量、分化阶段、细胞毒表型及耗竭受体谱方面的整体异常，丰富了RA免疫病理学框架。其次，研究证明γδ T细胞并非单纯旁观者，而可能参与慢性炎症维持及生物治疗应答调节。再次，研究提出γδ T细胞表面受体有望成为疾病活动度及抗TNF疗效评估的候选生物标志物，为未来精准监测提供基础。不过作者也强调，研究样本量较小，且为相对单一的波兰人群队列，部分相关性结果仍需更大样本和功能实验验证，因此结论应审慎解读。

主要技术方法概括：研究纳入34例RA患者和44名健康对照，RA样本来源于波兰国家卫生基金（NFZ）药物项目下接受抗TNF治疗的人群，并于基线、3个月和6个月连续采集外周血。采用多参数流式细胞术对γδ T细胞、Vδ1/Vδ2亚群及CD28、CD27、CD226、PD-1、TIM-3、TIGIT、CD16、CD56、CD45RA等表面分子进行免疫表型分析；使用FMO对照进行门控；结合DAS28、CRP、ESR等临床指标开展相关性分析，并通过ROC曲线评估候选受体对治疗应答和患者分层的判别价值。

以下为研究结果解读。

Characteristics of γδ T cells in RA patients compared to healthy controls
研究人员在CD3⁺淋巴细胞中鉴定γδ T细胞后发现，RA患者外周血γδ T细胞比例显著低于健康对照，且这一差异在治疗前和治疗6个月时均具有统计学意义。同时，在5万个采集事件中的γδ T细胞数量也显著减少。Vδ1和Vδ2亚群比例及其MFI未见显著差异，但外周血中Vδ2仍高于Vδ1。依据CD45RA与CD27表达进行分化分型后，RA患者γδ T细胞中TEMRA比例显著升高，而TCM比例下降，说明该细胞群呈现更高级分化和耗竭相关特征。

Reduction in γδ T-cell frequency and TCRγδ expression may be associated with poorer response to anti-TNF therapy
通过比较不同疗效患者在治疗6个月后的变化趋势，研究人员发现，抗TNF疗效较差者γδ T细胞比例及TCRγδ的MFI均呈下降趋势。尽管统计学上未达显著水平，但这一结果提示γδ T细胞数量减少和TCRγδ表达减弱可能与不良治疗反应有关，值得在更大样本中进一步验证。

Differences in surface receptor expression on γδ T cells
研究将受体分为活化性、抑制性以及细胞毒/成熟相关三类，并发现RA患者γδ T细胞受体谱发生系统性改变。活化性受体方面，CD28和DNAM-1阳性细胞比例下降，DNAM-1的MFI也降低，提示共刺激和激活能力削弱；CD27和NCR3也出现一定程度差异。抑制性受体方面，TIGIT升高最为突出，其阳性比例和MFI均高于健康对照，PD-1的MFI在各时点也持续升高，TIM-3阳性比例亦呈相似趋势。细胞毒/成熟相关标志物方面，CD56、CD16及CD45RA升高，表明RA中的γδ T细胞更偏向细胞毒性和终末成熟状态。

Opposing correlations between activating and inhibitory receptors and cytotoxicity-associated markers on γδ T cells in RA patients before treatment
在治疗前RA患者中，研究人员通过相关矩阵发现，CD28、CD27等活化受体与CD56、CD16、CD45RA等细胞毒和成熟相关标志物呈负相关；而TIM-3、TIGIT等抑制性受体则与CD45RA及CD16呈正相关。这说明γδ T细胞随着成熟和细胞毒性增强，往往伴随活化性受体下调和抑制性受体上调。上述相关性在抗TNF治疗过程中减弱或消失，健康对照中也仅表现为较弱关联，提示RA病理状态下受体调控网络具有特异性失衡。

Distinct correlations between receptors with divergent functions and clinical parameters in RA patients
研究将γδ T细胞总群、Vδ1、Vδ2及不同受体表达与CRP、ESR、NTJ、NSJ、VAS、DAS等临床参数进行关联。结果显示，总γδ T细胞及Vδ2亚群总体与临床炎症活动指标呈负相关，而Vδ1亚群更倾向于正相关。活化性受体如CD27、CD28、DNAM-1与临床不良参数多呈负相关；抑制性受体如TIGIT、TIM-3、PD-1则更常呈正相关。这些结果支持γδ T细胞功能状态与RA疾病活动度存在一致性联系。

γδ T cells and their receptors as a marker of effective therapy in RA
研究进一步利用ROC分析评价γδ T细胞及其受体作为良好抗TNF应答标志物的潜力。以6个月后DAS28下降≥1.2且达到低疾病活动度定义良好应答。结果提示，多项γδ T细胞参数具有一定判别价值，其中TIGIT⁺ γδ T细胞在阳性比例及MFI上的敏感度和特异度表现最为突出；CD56⁺、DNAM-1⁺和CD28⁺ γδ T细胞也显示出较好的区分能力。这表明γδ T细胞频率及受体表达可能反映与治疗获益相关的免疫学特征。

讨论部分总结：作者认为，γδ T细胞因其非MHC限制性识别方式及丰富的表面受体网络，在RA慢性炎症环境中具有重要调节作用。研究结果共同指向一个核心模式，即RA患者外周血γδ T细胞减少，且该细胞群向终末分化、细胞毒化和功能耗竭方向偏移；这一过程伴随活化受体下调和抑制受体上调，并与疾病活动度和抗TNF应答存在联系。文章同时指出，本研究存在年龄差异潜在混杂、数据维度较高导致相关性解释复杂、以及研究对象主要为波兰同质化人群等局限。但总体而言，该研究是少数将γδ T细胞免疫表型、临床指标和生物制剂疗效系统整合的工作之一，为RA中γδ T细胞的致病作用及其作为诊断和预后生物标志物的应用提供了有价值的基础。

研究结论翻译：总之，本研究首次对接受抗TNF治疗的RA患者γδ T细胞及其表面受体进行了较为全面的表征。研究人员证实：（1）RA中γδ T细胞比例降低；（2）γδ T细胞获得终末分化表型，并与耗竭状态一致；（3）抑制性受体表达增加，进一步支持耗竭特征；（4）相关受体可作为潜在诊断和预后标志物；（5）TCRγδ的比例及MFI变化可能有助于评估抗TNF治疗应答；（6）受体参数与疾病活动性的临床指标相关。尽管存在一定局限性，本研究仍为后续功能学研究和验证研究奠定了基础，并可能推动对γδ T细胞在RA发病机制中作用及其诊断、预后应用价值的进一步认识。