可注射预血管化海藻酸盐-胶原水凝胶持续递送miR-133a脂质纳米颗粒用于心肌修复

《Drug Delivery and Translational Research》：Injectable pre-vascularized alginate-collagen hydrogel with sustained delivery of miR-133a-loaded lipid nanoparticles for myocardial repair

　　

心肌梗死（myocardial infarction, MI) 仍是导致心力衰竭的主要原因，现有治疗手段无法阻止心肌细胞死亡或支持有效的组织再生。可注射水凝胶（injectable hydrogels, HGs) 已成为递送治疗信号和结构支撑的有前景平台；然而，鲜有系统能同时将血管化引导与RNA治疗相结合。本研究中，研究人员开发了一种温度敏感型海藻酸盐-胶原水凝胶，预血管化内皮细胞和成纤维细胞，并设计用于持续释放包裹于可电离脂质纳米颗粒（ionizable lipid nanoparticles, LNPs) 中的心肌保护性miR-133a。经微流控技术制备的miR-133a-LNPs展现出最佳理化性质、高效的内体逃逸及保留的生物活性。该水凝胶表现出剪切稀化、自愈合行为及温度触发的凝胶化，可实现微创递送及可控的miRNA释放。包埋细胞保持活力，组织成早期微血管网络，并分泌促血管生成因子。从水凝胶释放的miR-133a能够减弱心肌母细胞中氧化应激诱导的细胞凋亡。这一多功能平台整合了结构支撑、促血管生成信号及持续的抗凋亡miRNA递送，为减轻早期心肌损伤和促进MI后关键再生过程提供了有前景的策略。

心血管疾病仍是全球范围内导致死亡的首要原因，2021年造成约2050万人死亡。其中，心肌梗死每年影响近300万人。MI主要由冠状动脉内动脉粥样硬化斑块破裂引发，导致血栓形成和心肌缺血。氧气和营养物质的剥夺造成不可逆的心肌细胞死亡，触发强烈的炎症反应和不良心室重构，最终导致进行性心功能障碍，近50%的患者在MI后五年内死亡。现有药物治疗无法解决导致长期心功能障碍的心肌细胞不可逆丢失问题，而心脏移植受限于供体稀缺和重大手术风险。下一代MI治疗应超越症状缓解，主动恢复心肌结构和功能，增强心脏机械稳定性、限制细胞凋亡和纤维化并促进新生血管形成。

在此背景下，心脏组织工程作为一门整合生物材料、细胞和生物活性分子的多学科方法应运而生，以支持心肌修复。MI后，天然细胞外基质（extracellular matrix, ECM) 的组成和力学性质严重改变，导致细胞周转率降低并限制了内源性再生。为克服这些局限，生物材料被设计用于模拟天然ECM的结构、力学和生化特征，为组织修复提供支持性微环境。水凝胶因其高含水量、粘弹性及类组织力学特性而成为理想的生物材料，有助于促进细胞存活、支持血管生成并实现治疗剂的持续递送。在常用于制备水凝胶的天然聚合物中，胶原和海藻酸盐因其高生物相容性、胶原固有的生物活性以及海藻酸盐温和的离子介导凝胶化特性而尤为突出，使其特别适用于心脏应用。可注射水凝胶进一步通过刺激响应机制实现高浓度负载的位点特异性释放，同时允许微创给药和组织整合。

在新兴疗法中，非编码RNA，特别是微小RNA（microRNAs, miRNAs)，在调节梗死后血管生成、细胞凋亡和纤维化等过程中显示出潜力。其在转录后水平调控基因表达的能力使其成为心脏修复的有前景候选分子，特别是考虑到成年心肌细胞固有的有限再生能力——一生中仅约50%被替换，且随年龄增长周转率显著下降。microRNA-133a（miR-133a) 因其心肌保护特性而尤为 promising，包括下调促凋亡介质如caspase-9和caspase-3，以及减轻氧化应激，使其成为减少MI后心肌细胞凋亡的有潜力治疗性miRNA。然而，miRNA的临床转化面临重大挑战，包括系统循环中的快速降解、有限的细胞摄取、免疫原性、低效的内体逃逸及脱靶效应。可电离脂质纳米颗粒已被开发用于克服这些障碍，通过保护miRNA免受降解、增强细胞内化、内体释放及实现靶向心肌递送。此外，将LNPs整合到水凝胶中可增强miRNA稳定性和生物活性，实现持续、高度可控和精确的RNA释放，提高生物利用度，并允许调节水凝胶降解速率，较裸miRNA系统具有综合优势。

除分子治疗外，血管化对于恢复灌注、维持心肌细胞存活和支持MI后功能恢复至关重要。水凝胶除作为递送平台外，还可负载细胞（如内皮细胞和心脏成纤维 cells) 以促进血管生成等修复机制。近期研究表明，血管细胞植入后能够加速血管形成和心脏组织修复，这主要由细胞释放的旁分泌信号介导。在参与新血管形成的细胞中，内皮细胞通过分泌血管活性和促血管生成介质如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF) 发挥作用，在某些情况下直接形成微血管网络。近年来，支持细胞在形成稳定成熟血管中的重要作用被强调，如心脏成纤维细胞释放促血管生成因子，刺激内皮细胞增殖、迁移和管腔形成。在某些情况下，生物材料的应用促进外源细胞整合入宿主脉管系统，这一现象可通过体外成熟步骤诱导三维管状细胞组织成血管样结构并与宿主脉管吻合来促进。

尽管取得这些进展，现有方法仅处理心脏修复的一个或两个方面，或是RNA介导的心肌保护，或是血管化引导，或是结构支撑，但很少将三者整合于单一策略中。这限制了其应对MI后重构多因素性质的能力。结合机械增强水凝胶、微血管网络和可控miRNA递送的协调方法将更有效地靶向机械稳定、早期灌注和分子心肌保护。额外挑战包括miRNA不稳定性、有限的细胞存活率及可注射基质体内滞留性差，进一步强调了这种整合策略的必要性。

为应对这些局限，研究人员开发了一种温度敏感型海藻酸盐-胶原水凝胶，整合miR-133a负载的LNPs并预血管化内皮细胞和成纤维细胞，旨在创造一种协同微环境，支持细胞活力、促进血管生成并实现持续的抗凋亡信号传导。研究人员假设这一多功能系统将增强早期心肌保护并有利于MI后的关键再生过程。

**关键技术方法**：本研究采用微流控技术（Ignite NanoAssemblr?) 制备miR-133a-LNPs，使用动态光散射（DLS)、纳米颗粒追踪分析（NTA) 和低温透射电子显微镜（cryo-TEM) 进行理化表征；利用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM) 评估细胞摄取、内体逃逸途径及动力学；通过Caspase-Glo? 9检测试剂盒评价生物活性；采用海藻酸盐、I型胶原和葡萄糖酸钙制备温度敏感型水凝胶；运用扫描电子显微镜（SEM) 观察微结构；利用旋转流变仪进行振荡频率扫描、应变扫描和三步循环应变时间扫描以表征流变学性能；通过活/死染色和Alamar Blue法评估包埋细胞活力与代谢活性；采用酶联免疫吸附测定（ELISA) 定量VEGF-A分泌；借助免疫荧光染色检测CD31、von Willebrand因子（vWF) 和CD90表达；在模拟梗死心肌弱酸性环境（pH 6.2) 中进行体外释放实验；最终通过Annexin台北/碘化丙啶（PI) 流式细胞术验证抗凋亡活性。

**研究结果**

**miRNA负载LNP的制备与表征**：微流控制备的miR133a-LNPs表现出高度单分散和窄尺寸分布。DLS测得平均流体力学直径为95.9±2.4 nm，低PDI（0.039±0.009)。NTA确认平均流体力学直径为99.5±0.9 nm。表面电荷分析显示缓冲液交换后zeta电位为+15.86±0.87 mV，等电点约6.14。颗粒浓度达9.03×10¹⁴±1.27×10¹⁴ particles/mL，包封效率94.35%±2.45%，产率87.45%±1.54%。Cryo-TEM证实主要为球形囊泡，具有明确的多层内部结构和有序脂质堆积。

**心肌细胞对miR-133a-LNPs的内化及内体逃逸**：流式细胞术显示，H9C2细胞中44%在5小时内内化miR-133a-LNPs，16小时达97%；HL-1细胞24小时达95%。药理学抑制研究表明，4°C条件下摄取几乎完全被抑制，动力蛋白抑制剂（dynasore) 中度减少摄取，而网格蛋白介导的内吞（氯丙嗪抑制) 和小窝蛋白依赖途径（染料木素抑制) 几乎消除内化。巨胞饮抑制剂（EIPA和细胞松弛素D) 也减少摄取。共聚焦显微镜显示，H9C2细胞中内体逃逸在16小时开始明显，24小时更显著，胞质定位持续至48-72小时；HL-1细胞模式相似但动力学延迟。

**miR-133a-LNPs在心脏相关细胞类型中的细胞相容性**：MTS检测显示，miR-133a-LNPs对心肌母细胞和内皮细胞在任何测试浓度下均无显著活力降低。成纤维细胞在高浓度时出现代谢活性轻度下降，内皮细胞在低中浓度miR-133a-LNPs下表现出增强的代谢活性。

**心肌细胞凋亡模型中miR-133a-LNPs的生物活性**：miR-133a-LNPs使氧化应激后caspase-9活性降低32.6%±2.23%，而AMO-LNPs增加caspase-9活性，证实LNP递送的miR-133a保持功能生物活性。

**水凝胶的合成与表征**：海藻酸盐-胶原水凝胶通过将海藻酸盐水溶液与胶原混合，加入葡萄糖酸钙预交联制备，含1% (w/v) 海藻酸盐、2.5 mg/mL胶原和0.25% (w/v) 葡萄糖酸钙。SEM显示具有异质性和互联多孔形态。所有配方均表现出剪切稀化行为，温度诱导凝胶化前G'≈G''，37°C凝胶化后G'>G''，储能模量约10-60 Pa，估计杨氏模量约0.03-0.18 kPa。三步循环应变测试证实自愈合特性，高应变后G'快速恢复。

**水凝胶与内皮细胞和成纤维细胞的细胞相容性**：活/死染色显示注射后细胞存活率高于约98%，细胞均匀分布。Alamar Blue检测显示21天内代谢活性先降后稳，第3-7天出现短暂下降后稳定。

**细胞粘附和血管生成标志物表达特征**：DAPI和鬼笔环肽染色显示，水凝胶支持内皮细胞和成纤维细胞的粘附和持续增殖，第14天内皮细胞形成血管样结构，成纤维细胞形成球状集群，共培养中可见出芽。VEGF-A分泌在21天内持续。免疫荧光显示CD31、vWF和CD90表达，证实内皮和成纤维细胞表型维持及血管网络成熟启动。

**水凝胶中miR-133a和miR-133a-LNPs的体外释放研究**：12天内持续释放，7天时55.41%±4.56%的miR-133a-LNPs释放，32.52%±1.23%的miR-133a释放，与MI亚急性期时间窗一致。

**纳米复合细胞负载水凝胶在H9C2心肌母细胞中的抗凋亡活性**：H₂O₂使早期凋亡增至25.10%±4.71%，晚期凋亡25.75%±1.38%，坏死10.59%±3.38%。纳米复合细胞负载水凝胶显著减弱凋亡，早期凋亡降至13.81%±2.08%，晚期凋亡18.35%±2.19%，坏死7.95%±1.23%，细胞活力恢复至60.22%±2.36%。

**讨论部分总结与结论翻译**：尽管该平台的体外性能 promising，其临床转化仍需应对与多功能先进治疗药品相关的挑战，包括生物材料基质、脂质纳米颗粒和活细胞组合带来的制造复杂性、灭菌、储存稳定性、批次间重现性和大规模生产问题，以及细胞和纳米材料联合治疗的法规考量。未来研究应不仅关注体内疗效和安全性，还需关注可制造性、可扩展性、长期储存及与临床相关递送系统的兼容性。

结论：研究人员开发并表征了一种基于可注射、温度敏感型海藻酸盐-胶原水凝胶的多功能治疗平台，该平台整合内皮细胞、成纤维细胞和miR-133a负载的LNPs。LNPs的微流控制备实现了高效的miR-133a包封、有利的理化性质和有效的心肌细胞摄取，导致氧化应激下caspase-9激活和细胞凋亡减少。该水凝胶由可注射、机械坚韧的基质组成，具有适合心肌内给药的剪切稀化、温度敏感和自愈合特性。其多孔互联结构支持细胞容纳，包埋的内皮细胞和成纤维细胞保持活力及代谢活性，自我组织成血管样网络，维持其血管生成表型并分泌VEGF。通过将可控miRNA递送与促血管生成细胞活性结合于单一可注射构建体中，该纳米复合水凝胶创造了限制心肌细胞凋亡和支持心肌修复关键过程的再生微环境。总体而言，这些发现支持该多功能平台用于心肌修复的潜力，并为未来体内评估提供了坚实基础。