Calpeptin(钙蛋白酶抑制剂)抑制Calpain(钙激活中性蛋白酶)对脂肪细胞脂质代谢及脂肪细胞来源分泌组介导的与肝细胞炎性互谈(inflammatory crosstalk)的调控作用

《Inflammation Research》：Calpain inhibition by calpeptin modulates adipocyte lipid metabolism and secretome-mediated inflammatory crosstalk with hepatocytes

　　

： 目的：Calpeptin是一种具有治疗炎症性疾病潜力的Calpain(钙依赖性半胱氨酸蛋白酶)抑制剂，可减少细胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)分泌。虽然脂肪组织是公认的Calpeptin作用靶点，其对脂质代谢的影响尚不清楚。研究人员探讨了Calpeptin对人Simpson-Golabi-Behmel Syndrome(SGBS)脂肪细胞及其来源EV中脂肪酸(fatty acid, FA)谱及代谢途径的影响。 方法：脂肪细胞经25或50 μM Calpeptin处理，条件培养基(conditioned medium, CM)中EV经超速离心法分离。永生化人肝细胞(immortalized human hepatocyte, IHH)先经0或400 μM棕榈酸(palmitic acid, PA)预处理，再暴露于Calpeptin处理脂肪细胞的CM。总脂质FA组成采用气相色谱-质谱(gas chromatography–mass spectrometry, GC-MS)测定，基因表达采用RNA测序(RNA-sequencing, RNA-seq)和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)检测，随后进行单变量和多变量统计及通路分析。 结果：Calpeptin降低脂肪细胞中EV分泌及花生四烯酸(arachidonic acid, AA; 20:4n-6)比例，同时扰动关键代谢途径包括膳食必需多不饱和脂肪酸(polyunsaturated FA, PUFA)代谢途径。与Calpeptin处理相关的潜在生物标志物候选物包括C20–22 PUFA(脂肪细胞)和23:0(EV)。PA及Calpeptin处理脂肪细胞来源分泌组均诱导IHH产生促炎反应。 结论：结果表明Calpeptin可能调节脂肪细胞脂质代谢及EV分泌，伴随的肝细胞炎症反应很可能由脂肪细胞来源分泌因子介导。这些观察结果提示需在代谢性疾病背景下进一步探究Calpeptin潜在的不良效应。

论文解读：

本研究发表于《Inflammation Research》。

【研究背景】

Calpain(钙激活中性蛋白酶，calcium-dependent cysteine protease)是参与细胞骨架重塑、信号转导及凋亡的钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶，Calpeptin为其特异性抑制剂，在急性肾损伤、胰腺癌、肺纤维化及神经退行性疾病中被认为具有抗炎潜力。既往研究发现Calpeptin可减少多种细胞类型细胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)的分泌，并在小鼠脂肪组织中通过Calpastatin过表达减轻脂肪细胞凋亡、巨噬细胞浸润及纤维化，提示其可调节肥胖相关脂肪组织炎症。Calpain亦参与胰岛素信号转导中GLUT4囊泡转位及葡萄糖摄取。然而，Calpeptin对脂肪细胞脂质代谢——特别是脂肪酸(fatty acid, FA)组成、多不饱和脂肪酸(polyunsaturated FA, PUFA)平衡及相关代谢通路的具体影响尚未见报道。脂肪组织来源EV及其携带的脂质、蛋白、RNA参与脂肪组织-肝脏互作(adipose tissue–liver crosstalk)，可影响肝细胞炎症状态。因此，在Calpeptin被探索用于肥胖相关疾病治疗时，明确其对人类脂肪细胞FA代谢及下游肝细胞炎症通讯的影响具有重要意义。本研究旨在探究Calpeptin是否改变脂肪细胞及EV中FA谱、干扰PUFA代谢通路，并考察Calpeptin处理脂肪细胞的条件培养基(conditioned medium, CM)对肝细胞炎症基因表达的影响。

【主要关键技术方法】

研究人员采用人Simpson-Golabi-Behmel Syndrome(SGBS)前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞作为体外人脂肪细胞模型；脂肪细胞经25 μM或50 μM Calpeptin处理24 h，CM经0.22 μm过滤及10,000×g和110,000×g两步超速离心分离EV并进行纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)、透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)及Western blot鉴定；脂肪细胞及EV总脂质FA组成经气相色谱-质谱(gas chromatography–mass spectrometry, GC-MS)进行FA甲酯衍生化后定量并以摩尔百分比(mol-%)表示；部分数据(包括Calpain蛋白表达、EV分泌量、EV表征、部分基因表达)引用自已发表数据集。脂肪细胞RNA提取后经Smart-Seq建库进行RNA测序(RNA-sequencing, RNA-seq)，差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)以错误发现率(false discovery rate, FDR)<0.05为标准；另以实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)验证脂质代谢相关基因，内参基因为HPRT1(脂肪细胞)和GAPDH(肝细胞)。永生化人肝细胞(immortalized human hepatocyte, IHH)经400 μM棕榈酸(palmitic acid, PA; 16:0)-BSA复合物预处理24 h模拟脂毒性炎症状态，再以Calpeptin处理脂肪细胞的CM按1:1稀释培养IHH 6 h，收集细胞检测炎症基因表达。FA数据经MetaboAnalyst 6.0进行中位数标准化、对数转换、主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)、变量重要性投影(variable importance in projection, VIP)评分及代谢物集富集分析(metabolite set enrichment analysis)；ROC曲线评估生物标志物潜力；DEG导入STRING数据库进行蛋白-蛋白互作(protein–protein interaction, PPI)网络及Gene Ontology(GO)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析；组间比较采用Kruskal–Wallis检验及Mann–Whitney U检验，p<0.05为差异显著。

【研究结果】

■ 选择性FA掺入EV

相比供体SGBS脂肪细胞，EV中总饱和FA(saturated FA, SFA)、n-6及n-3 PUFA比例升高，总单不饱和FA(monounsaturated FA, MUFA)比例降低；多个直链及支链SFA(C12–C24)、缩醛磷脂二甲基乙缩醛(dimethyl acetal, DMA)16:0和DMA 18:0在EV中比例更高，EV的不饱和FA(UFA)/SFA比值低于细胞。部分长链MUFA(C22–C24)及DMA 18:1n-9、DMA 18:1n-7在EV中比例升高。n-3 PUFA(18:3n-3至22:6n-3)及n-3/n-6 PUFA比值、部分n-6 PUFA(18:2n-6至22:5n-6)在EV中升高，Δ⁶-脱饱和指数(Δ⁶-desaturation index)升高而Δ⁵-脱饱和指数及产物/前体比降低。PCA可将细胞组与EV组明显分开，表明FA选择性分选进入EV，且EV FA谱反映供体细胞代谢特征。

■ Calpeptin对SGBS脂肪细胞FA的影响

25 μM和50 μM Calpeptin均显著降低脂肪细胞中20:4n-6(AA)及DMA 16:0比例(p=0.038)；50 μM Calpeptin额外降低18:1n-5、22:3n-9、22:5n-6、总n-6 PUFA及总PUFA比例，20:5n-3(EPA)、22:4n-6及n-3 PUFA总和呈下降趋势(p=0.062–0.082)。代谢物集富集分析显示25 μM和50 μM Calpeptin均扰动18:3n-3和18:2n-6代谢、20:4n-6代谢、缩醛磷脂合成、长链SFA线粒体β-氧化通路。VIP分析显示C20–22 n-6/n-3 PUFA(20:4n-6、22:4n-6、22:5n-6、20:5n-3、22:5n-3等)及18:3n-3对区分Calpeptin处理组与对照组贡献最大，ROC分析AUC=1.000(小样本初探)。FA代谢网络随Calpeptin浓度增加密度增大，提示FA间代谢关联被重排。结论：Calpeptin下调脂肪细胞中AA及部分PUFA比例并扰乱必需PUFA代谢及缩醛磷脂合成相关通路，C20–22 PUFA可作为Calpeptin暴露的潜在脂肪细胞FA生物标志物。

■ Calpeptin对SGBS脂肪细胞来源EV中FA的影响

50 μM Calpeptin使EV中二十烷酸(20:0)比例下降(p=0.030)。代谢通路富集提示20:4n-6代谢、FA延伸、β-氧化等在EV中有改变趋势但未达显著性。PLS-DA可区分50 μM组与对照EV。VIP分析显示23:0(三十三烷酸，tricosanoic acid)、19:0、20:0、20:2n-6、22:4n-3等对区分Calpeptin处理EV与对照贡献最高，其中23:0的ROC分析AUC=1.000(小样本初探)。FA关联网络在Calpeptin处理后EV中密度增加并出现PUFA枢纽(如20:3n-6)。结论：Calpeptin轻度改变EV FA组成，23:0等微量SFA及特定PUFA可作为Calpeptin处理EV的潜在FA生物标志物。

■ Calpeptin对脂肪细胞和肝细胞基因表达的影响

RNA-seq显示50 μM Calpeptin下调SGBS脂肪细胞中PLIN1(perilipin 1)、DGAT2(diacylglycerol O-acyltransferase 2)、ELOVL6(ELOVL fatty acid elongase 6)、ANGPTL8(angiopoietin-like 8)，上调PLIN4；qPCR证实ACACB(acetyl-CoA carboxylase beta)、PNPLA2(patatin like domain 2, triacylglycerol lipase/ATGL)、SREBF1(sterol regulatory element binding transcription factor 1)、PPARG(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)在25和/或50 μM Calpeptin下显著下调，ACACA无变化。GO分析富集于脂质储存调节、FA代谢过程、酰基辅酶A代谢过程等；KEGG富集FA代谢、AMPK信号、胰高血糖素信号、胰岛素抵抗及脂肪细胞因子信号通路；PPI网络具高聚类系数(PPI enrichment p<1.0×10^?16)。IHH经Calpeptin处理脂肪细胞CM处理后，IL6(interleukin-6)、TNFA(tumor necrosis factor alpha)、CXCL8(C-X-C motif chemokine ligand 8/IL-8)mRNA表达显著上调(p=0.029)，IL1B及PPARG无显著变化；PA预处理的IHH再用CM处理未进一步放大炎症基因表达。结论：Calpeptin抑制脂肪细胞中脂质合成、脂滴包被及部分脂解/脂生成关键转录调节因子；Calpeptin改变脂肪细胞分泌组组成，该分泌组可在肝细胞中诱发促炎基因表达上调，提示脂肪组织来源分泌因子而非EV单独介导肝细胞炎症激活。

【讨论与结论翻译】

讨论指出Calpeptin降低脂肪细胞中促炎性AA等n-6 PUFA比例的同时也降低具抗炎/促消退潜能的n-3 PUFA前体比例，且未影响促炎SFA(如PA)比例，其代谢效应具双向复杂性；Calpeptin还下调SREBF1、PPARG及脂合成/脂滴相关基因，提示可能影响脂肪细胞脂质储存与周转。EV FA呈选择性分选，Calpeptin影响EV分泌及潜在脂质包装。重要的是，Calpeptin处理脂肪细胞CM在IHH中诱导促炎基因表达，提示脂肪组织Calpain抑制可产生非预期的促炎旁分泌效应作用于肝脏，与肝脏局部Calpain抑制的抗炎保护作用不同，强调组织特异性评价必要性。研究受限于小样本量、未检测PUFA衍生活性脂质介质(LM)、CM可能含残留Calpeptin、炎症仅检测mRNA水平、EV为混合群体等，需体内验证。

结论翻译：尽管Calpeptin此前显示出抗炎、抗纤维化及抗病毒潜力，本研究结果表明其代谢效应需谨慎、按情境重新评估。Calpeptin干扰脂肪细胞PUFA(尤其饮食必需PUFA)代谢及类花生酸/消退脂质介质(lipid mediator, LM)通路，并可能以复杂且潜在不利方式破坏促炎与抗炎PUFA衍生代谢物平衡。肝细胞数据强调在临床应用前须评估Calpain抑制的组织特异性及器官间后果。总体而言Calpeptin治疗价值仍不确定，Calpain抑制在代谢病背景下可能产生混合甚至不良效应。本结论限于体外细胞模型，需动物实验验证体内真实性。