PKA信号调控PRMT5/hnRNP A1介导的IRES翻译并决定胶质母细胞瘤中对mTOR抑制剂的反应

《Journal of Neuro-Oncology》：PKA signaling modulates PRMT5/hnRNP A1-mediated IRES translation and dictates responses to mTOR inhibition in glioblastoma

　　

摘要： 胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）中对mTOR抑制剂的耐药性部分由内部核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site, IRES）依赖的翻译激活介导，使关键细胞周期调节因子的合成得以持续。该代偿机制涉及蛋白精氨酸甲基转移酶5（Protein Arginine Methyltransferase 5, PRMT5）对IRES反式作用因子（IRES-trans-acting Factor, ITAF）hnRNP A1的甲基化依赖性激活，但其上游调控机制尚不清楚。研究人员通过酵母双杂交筛选发现PKA催化亚基α（PKA-Cα）与PRMT5相互作用，并在GBM细胞中经免疫共沉淀和共定位验证。通过生化、遗传及药理学手段调控PKA活性并检测对PRMT5磷酸化、hnRNP A1精氨酸对称二甲基化（Symmetric Dimethylation of Arginine, SDMA，R218/R225）、IRES活性及mTOR抑制剂耐药的影响。结果显示mTOR抑制可激活PKA并与PRMT5结合，伴随cyclin D1和c-myc mRNA的IRES活性升高；PKA敲低或抑制可削弱mTOR抑制剂诱导的IRES激活。PKA可使PRMT5第15位丝氨酸（Ser15）磷酸化，该修饰是PRMT5–hnRNP A1互伤及下游hnRNP A1 R218/R225对称二甲基化所必需的；非磷酸化突变体PRMT5 S15A无法结合hnRNP A1，而磷酸模拟突变体S15E增强二者结合。PKA激活增加hnRNP A1甲基化；PKA与mTOR双重抑制降低GBM细胞活力、抑制IRES介导翻译并在体外及颅内异种移植模型中诱导凋亡。研究表明PKA/PRMT5/hnRNP A1信号轴促进IRES依赖翻译并参与GBM中mTOR抑制剂耐药，联合抑制PKA与mTOR是具有潜力的治疗策略。

论文解读：

本研究发表于《Journal of Neuro-Oncology》。胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）因手术难以全切及获得性耐药导致预后极差，mTOR抑制剂单药临床疗效有限。既往研究发现mTOR抑制可触发IRES（Internal Ribosome Entry Site，内部核糖体进入位点）依赖的代偿翻译，使cyclin D1和c-myc等促癌蛋白继续合成，该过程依赖PRMT5（Protein Arginine Methyltransferase 5，蛋白精氨酸甲基转移酶5）对ITAF（IRES-trans-acting Factor，IRES反式作用因子）hnRNP A1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1）R218/R225位精氨酸的对称二甲基化（Symmetric Dimethylation of Arginine, SDMA），但PRMT5/hnRNP A1轴的上游调控不明。研究人员假设上游激酶调控PRMT5活性以介导该耐药通路，通过酵母双杂交筛选鉴定PKA（Protein Kinase A／cAMP-dependent Protein Kinase，蛋白激酶A）催化亚基PKA-Cα为PRMT5结合蛋白，进而在GBM细胞系（LN229）及患者来源异种移植（Patient-Derived Xenograft, PDX）细胞系HK296中证实PKA-Cα与PRMT5相互作用，并揭示mTOR抑制激活PKA，PKA磷酸化PRMT5 Ser¹⁵促进PRMT5–hnRNP A1结合及hnRNP A1甲基化，激活cyclin D1和c-myc IRES翻译导致耐药；联合抑制PKA与mTOR在体外及原位移植模型中协同抑制肿瘤生长并延长生存。该研究阐明PKA/PRMT5/hnRNP A1为GBM中mTOR抑制剂耐药的新机制，提出双重靶向PKA和mTOR的治疗新策略。

主要关键技术方法：采用酵母双杂交筛选以人全长PRMT5为诱饵鉴定互作蛋白PKA-Cα并做缺失突变域定位；GBM细胞系LN229及PDX来源HK296细胞行内源性免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）与免疫荧光共定位验证蛋白互作；体外激酶实验验证PKA催化PRMT5 Ser¹⁵磷酸化（以S15A突变体为对照）；CRISPR-Cas9敲除PRMT5后回补野生型及各突变体重建细胞系检测PRMT5–hnRNP A1结合及hnRNP A1 SDMA水平；双荧光素酶IRES报告系统检测cyclin D1及c-myc IRES活性；PKA活性测定、Annexin V及Caspase-3检测凋亡；蔗糖密度梯度离心多聚核糖体分析（Polysome Analysis）检测mRNA翻译效率；裸鼠颅内LN229-luciferase异种移植模型评估单药及联合用药（mTOR抑制剂Rapalink-1即RL1与PKA抑制剂Rp-8-Br-cAMPS）体内抑瘤效果与生存分析。

研究结果：

PKA-Cα interacts with PRMT5

酵母双杂交筛选以全长人PRMT5为诱饵发现PKA-Cα为其互作蛋白（占回收克隆7%），缺失突变定位显示PKA-Cα C端91氨基酸残基与PRMT5甲基转移酶结构域（159氨基酸残基）为互作必需区。结论：PKA-Cα与PRMT5通过特定结构域直接结合。

PKA-Cα associates with PRMT5 in GBM lines

在LN229及HK296细胞中内源性Co-IP证实PRMT5与PKA-Cα相互共沉淀，且mTOR抑制剂PP242处理增强二者结合；免疫荧光共聚焦显示二者胞质部分共定位，PP242处理后Pearson系数增高。结论：GBM细胞中PKA-Cα与PRMT5组成性结合，mTOR抑制增强其相互作用与共定位。

PKA activity is induced following mTOR inhibition, is required for mTOR inhibitor-induced IRES activity, and stimulates PRMT5/hnRNP A1 signaling

Rapamycin、PP242、RL1处理均激活PKA；PKA-Cα siRNA敲低阻断RL1诱导的cyclin D1和c-myc IRES活性。体外激酶实验证实重组PKA磷酸化野生型PRMT5而不磷酸化S15A突变体；PRMT5 KO细胞中回补WT PRMT5时PKA抑制剂Rp-8-Br-cAMPS或S15A突变体均削弱hnRNP A1结合，S15E突变体增强结合；PKA激动剂6-Benz-cAMP上调hnRNP A1 R218/R225 SDMA。结论：mTOR抑制激活PKA，PKA磷酸化PRMT5 Ser¹⁵是PRMT5结合hnRNP A1及催化hnRNP A1对称二甲基化、激活IRES翻译的必要步骤。

Anti-glioblastoma effects of combined PKA and mTOR inhibition

Rp-8-Br-cAMPS单独对细胞活力影响小，但与RL1联用在LN229和HK296中显著抑制活力（协同指数CI＜0.3），增加Annexin V阳性细胞及Caspase-3活化；多聚核糖体分析显示联合处理使cyclin D1和c-myc mRNA更多滞留于非核糖体/单体组分、翻译效率大幅下降，蛋白水平降低。结论：PKA抑制阻断mTOR抑制剂诱导的IRES代偿翻译，与mTOR抑制具强协同抗GBM效应。

Combination therapy of Rp-8-Br-cAMPS and RL1 in intracranial GBM xenografts

颅内异种移植小鼠中RL1单药抑瘤69%，Rp-8-Br-cAMPS单药无显著抑瘤，联合用药抑瘤94%并显著延长中位生存期；联合组移植瘤TUNEL阳性细胞增多，Cyclin D1和c-MYC阳性细胞减少，瘤组织多聚核糖体分析示cyclin D1和c-myc翻译效率进一步降低，RL1处理瘤内PKA活性升高验证体内一致性。结论：体内联合抑制PKA与mTOR克服mTOR抑制剂单药耐药，强效抑制原位GBM生长。

讨论部分总结：本研究延伸了PRMT5–hnRNP A1–IRES耐药轴上游机制，证实PKA是该轴正向调控者——mTOR抑制激活PKA，PKA磷酸化PRMT5 Ser¹⁵促进PRMT5–hnRNP A1结合及hnRNP A1 SDMA，激活cyclin D1和c-myc IRES翻译致耐药。PKA-Cα C端结合PRMT5甲基转移酶域可能通过变构促进N端Ser¹⁵被磷酸化。PKA还调控其他ITAF（如PTB）影响IRES，本研究首次明确其对PRMT5/hnRNP A1轴的直接调控。mTOR抑制激活PKA的机制可能与反馈性RTK/PI3K上调和cAMP动态改变有关。PKA在GBM具双重角色，此处证明其介导耐药。局限性含未用PDX原位模型评估联合用药，未来需补充。综上，PKA/PRMT5/hnRNP A1轴是GBM中mTOR抑制剂耐药的关键通路，联合抑制PKA与mTOR具转化价值。

结论（翻译）：上述发现确定了PKA/PRMT5/hnRNP A1信号轴可促进IRES依赖翻译并促成GBM中对mTOR抑制剂的耐药性。双重抑制PKA与mTOR可能代表一种有前景的治疗策略。