MAML1异常液-液相分离通过抑制Notch活性导致先天性心脏病

《Circulation》：Aberrant Phase Separation of Endothelial MAML1 Causes Congenital Heart Disease by Suppressing Notch Activity

　　

背景：先天性心脏病（CHD)是最常见的出生缺陷，也是婴儿死亡的主要原因，常与失调的Notch信号通路相关。然而，Notch转录共激活因子Mastermind-like 1 (MAML1)在CHD发病中的作用及其潜在分子机制尚不清楚。方法：研究人员通过聚焦于患者来源的Q401K突变敲入小鼠模型和心内膜特异性Maml1敲除小鼠模型，并结合CRISPR编辑的人心脏类器官，探究了MAML1在CHD中的作用。通过超声心动图和组织学分析评估心脏表型。通过生化实验、显微镜分析液-液相分离(LLPS)以及质谱鉴定蛋白质翻译后修饰和MAML1上游激酶来剖析潜在的分子机制。结果：在一组CHD患者临床队列中，研究人员鉴定出与心室间隔缺损相关的MAML1罕见错义变异。在敲入小鼠和人心脏类器官中模拟患者来源的变异(Q401K)足以重现关键的心室间隔缺损相关表型。为证实组织特异性致病性，研究人员证明小鼠心内膜特异性敲除MAML1以及人心脏类器官中MAML1缺失通过破坏Notch驱动的心内膜-间充质转化(EndMT)引起类似的间隔和瓣膜缺陷。机制上，研究人员发现MAML1活性依赖于LLPS，其形成核凝聚体，这对于NOTCH1胞内域(NICD1)的有效相互作用和下游转录靶点的激活是必需的。关键的是，患者来源的致病变异（包括Q401K）作为内在无序区2(IDR2)内的电荷改变突变发挥作用，IDR2是MAML1 LLPS的核心区域，病理性地消除LLPS从而下调Notch信号。此外，研究人员鉴定了一个调控轴，其中PKN2在Ser³¹⁴位点磷酸化MAML1，这使MAML1凝聚体不稳定并从而减弱Notch转录输出。结论：这些发现支持MAML1作为CHD的候选基因，并鉴定MAML1 LLPS为心内膜细胞中Notch转录输出的关键生物物理决定因素。MAML1凝聚体的静电完整性对心脏形态发生期间Notch信号通路的适当调控至关重要。该状态的失调，无论是通过CHD相关电荷改变变异还是异常PKN2介导的磷酸化，均会损害Notch信号通路并破坏心内膜-间充质转化，从而建立导致先天性心脏畸形的汇聚分子机制。

本研究发表于《Circulation》，揭示了MAML1异常液-液相分离作为先天性心脏病新型分子发病机制的核心发现。

研究背景与问题：先天性心脏病(Congenital Heart Disease，CHD)是最常见的出生缺陷，约影响1%的活产婴儿，是婴儿死亡的主要原因。约40%-50%的CHD病例估计存在遗传因素，但大多数病例的致病基因及相关机制尚不完全清楚。心室间隔缺损(Ventricular Septal Defect，VSD)是CHD最常见的亚型，约占30%-40%。心脏间隔和瓣膜的形成依赖于心内膜-间充质转化(Endocardial-to-Mesenchymal Transition，EndMT)这一精确调控的过程。Notch信号通路是EndMT的核心调控因子，其遗传 disruption 是CHD的已知原因。在Notch通路中，配体结合触发Notch胞内域(NICD)的蛋白酶解释放，NICD转位至细胞核，与DNA结合蛋白RBPJ和转录共激活因子MAML1形成转录复合物，诱导EndMT促进型转录程序。Maml1缺失会减弱Notch依赖性转录，纯合缺失导致围产期致死。然而，MAML1变异如何扰动Notch信号和EndMT以驱动间隔和瓣膜畸形尚不清楚。液-液相分离(Liquid-Liquid Phase Separation，LLPS)作为细胞组织的基本原则，促进生物分子凝聚体的形成，是增强转录活性的枢纽。异常LLPS已涉及心力衰竭和心肌病等心血管病理，但LLPS失调是否贡献于CHD尚不清楚。

为探究MAML1在CHD中的作用，研究人员首先在一个由412例散发性CHD患者和213例健康对照组成的北方汉族队列中重新分析了靶向捕获测序数据，鉴定出8种患者特异性的MAML1杂合错义变异，所有变异携带者均表现VSD。为确定这些变异的致病性，研究人员构建了Maml1-Q408K敲入小鼠（对应于人MAML1-Q401K位点），并利用CRISPR编辑的人胚胎干细胞(hESCs)建立了人心脏类器官(Human Heart Organoids，HHOs)模型。同时，研究人员生成了心内膜特异性Maml1条件性敲除小鼠，以明确MAML1在特定细胞类型中的功能。在分子机制研究方面，研究人员运用生化实验、活细胞成像、荧光漂白恢复(FRAP)显微镜分析LLPS特性，并通过质谱鉴定蛋白质翻译后修饰及上游激酶。

研究结果显示，在患者来源变异的研究中，Q401K变异在双荧光素酶实验中对Notch报告活性的抑制最为显著。Maml1-Q408K纯合敲入小鼠在P0.5时表现心脏缩小、心脏重量/体重比降低、VSD和主动脉二叶瓣(Bicuspid Aortic Valve，BAV)发生率升高，主动脉瓣叶增厚。6周龄时超声心动图显示射血分数降低和室间隔厚度减小。E11.5心脏内皮细胞中内皮标志物(CD31、VE-cadherin)升高而间充质标志物(PDGFR-α、N-cadherin、Vimentin)降低，Notch靶基因Hey1和Snai1下调。谱系示踪证实Q408K纯合小鼠流出道垫中EndMT显著减少。人心脏类器官中，MAML1-Q401K突变导致类器官体积缩小、EndMT抑制、Notch靶基因HEY1和SNAI1下调。

在心内膜特异性MAML1功能研究中，单细胞RNA测序显示MAML1优先表达于内皮细胞。Npr3-CreER介导的心内膜特异性Maml1敲除导致P0.5时心脏重量降低、VSD和BAV发生率升高、主动脉瓣叶增厚、射血分数和室间隔厚度降低。E11.5心脏内皮细胞中间充质标志物降低，Hey1和Snai1下调，流出道垫中EndMT减少。MAML1敲除的人心脏类器官表现类似：发育延迟、体积减小、EndMT抑制、Notch靶基因下调。

在MAML1 LLPS特性研究中，研究人员发现MAML1在细胞核内形成动态点状结构，经历自发融合事件，FRAP显示快速恢复动力学，1,6-己二醇处理消除这些颗粒。纯化MAML1-GFP蛋白在体外形成球形液滴，可融合、快速荧光恢复，并对1,6-己二醇和高盐浓度敏感。MAML1包含N端NICD结合域和核定位序列，IDR占据大部分序列。截断实验表明IDR2是LLPS的主要介导区域，仅保留NICD结合域和IDR2的最小构建体足以形成具有动态FRAP行为的液滴。1,6-己二醇破坏MAML1相分离后，其与NICD1的结合减少，Notch靶基因表达下降。

在致病变异机制研究中，8种患者错义变异中5种(Q401K、T433K、E553K、N580K、M698R)显著损害液滴形成，其中Q401K和T433K位于IDR2内且对Notch活性和相分离的抑制最为严重。Q408K纯合小鼠心脏内皮细胞中MAML1液滴数量显著减少。纯化Q401K蛋白形成更少、动态性更差的液滴，FRAP恢复更慢，与NICD1的相互作用显著降低。

在翻译后修饰调控研究中，质谱鉴定显示MAML1在IDR2内的S314和S360位点存在磷酸化。S314A突变降低整体磷酸化水平，证实S314是主要磷酸化位点。磷酸化模拟突变S314D抑制MAML1相分离、减少与NICD1的共定位及相互作用、降低Notch信号活性；磷酸化缺陷突变S314A则增强凝聚体形成和NICD1相互作用，上调Notch信号。通过质谱筛选和激酶抑制剂实验，研究人员确定PKN2为MAML1 S314的上游激酶。PKN2过表达增强S314磷酸化并抑制MAML1相分离；siRNA敲低PKN2或减少其磷酸化并促进凝聚体形成；PKN2抑制剂PKN1/2-IN-1降低S314磷酸化并促进相分离。体外激酶实验证实PKN2直接磷酸化MAML1 S314并抑制其相分离。发育时间进程分析显示，EndMT关键窗口期(E11.5)心脏内皮细胞中PKN2低表达、S314磷酸化水平低，维持MAML1凝聚体；发育后期PKN2上调，通过增强磷酸化修饰减弱MAML1相分离，伴随Notch靶基因转录下调。功能实验中，MAML1-S314D突变减少人心脏类器官大小、抑制EndMT、下调Notch靶基因表达；S314A突变则促进类器官发育和EndMT。PKN2过表达抑制野生型类器官发育和EndMT，但对S314A/D突变类器官无显著影响。

讨论部分，研究人员指出MAML1 LLPS的破坏是CHD的新型分子发病机制，建立了凝聚体动力学与CHD之间的直接联系。MAML1的共激活功能依赖于其LLPS能力，IDR2是致病变异的热点区域。PKN2作为MAML1 LLPS和Notch信号的关键负调控因子，在EndMT高峰期维持低水平以使MAML1保持去磷酸化和相分离状态，随后随PKN2水平上升而溶解凝聚体、关闭Notch信号。人心脏类器官作为三维体外平台，更忠实地模拟早期人类心脏发生，支持CHD研究和候选药物筛选。

研究结论：MAML1 IDR2的静电电荷是整合遗传和翻译后输入以控制心脏发育的关键调控节点。MAML1凝聚体开关可作为潜在的诊断和治疗靶点。该域内的电荷改变变异值得纳入CHD产前风险筛查，调控PKN2-MAML1轴可能代表未来治疗干预的策略。