通过先进的沉积策略设计和验证一种具有生物活性和抗菌功能的涂层，以应用于生物医学领域

《Biomaterials Science》：Design and validation of a bioactive and antimicrobial coating through advanced deposition strategies for biomedical applications

　　种植体周围感染仍然是影响牙科种植体长期生物整合的主要挑战，需要开发既能防止细菌感染又能促进软组织整合的涂层策略。在这里，我们报道了一种双功能聚电解质多层逐层（Layer-by-Layer, LbL）涂层，该涂层结合了聚（L-赖氨酸）（PLL30）、透明质酸（HA）和纤维连接蛋白（Fn），通过结构控制进行合理设计，并从浸涂技术转化为临床可应用的喷雾辅助沉积技术。多层涂层是通过浸涂法制备的，其中Fn可以贯穿整个薄膜或仅限于最外层。系统优化表明，Fn的末端限制——顶层Fn结构（PLL30-HA）6 + (PLL30-Fn)6——能够完全抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和聚合放线菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）的附着，同时保持细胞相容性（78%的人牙龈成纤维细胞存活率），而Fn贯穿整个薄膜则会损害细胞相容性，尽管对细菌附着的抑制效果相同。这种结构成功地通过双注射器喷雾装置转化为临床可扩展的喷雾辅助沉积技术（涂层时间<1分钟）。喷雾涂层的钛表面保持了双功能性，显著减少了金黄色葡萄球菌的数量，并完全抑制了聚合放线菌，血清涂层预处理后成纤维细胞存活率为88%。这项工作为双功能涂层的临床应用建立了一条转化途径，为预防和治疗种植体周围炎及其他种植体相关感染提供了可能性。

引言

牙科种植体已成为牙齿替代的标准治疗方法，在过去二十年里，美国缺牙成年人的使用率显著增加，这一趋势受到人口老龄化和临床效果改善的推动。尽管种植体的十年存活率超过95%，但种植体周围炎仍然是一个主要的生物学并发症，威胁着种植体的长期成功。种植体周围炎的特点是骨整合种植体周围的进行性骨吸收，主要由种植体-软组织界面处的细菌生物膜积累引起。系统综述显示，患者层面的患病率在10%到45%之间，具体取决于诊断标准和随访时间。目前的治疗方法，包括机械清创、全身抗生素和外科干预，往往无法防止疾病复发，也不能确保长期稳定性。随着牙科种植体使用的增加以及现有治疗方法效果的有限，迫切需要针对种植体周围炎根本原因的预防和治疗策略。种植体周围炎的发病机制与两个相互关联的因素密切相关：细菌定植和种植体周围软组织的密封不足。与天然牙齿不同，天然牙齿具有包括牙骨质、牙周韧带和连接上皮在内的强健的牙周附着，而牙科种植体依赖于主要通过半桥粒附着在钛表面的较弱密封。这种受损的屏障使得细菌容易渗透到种植体周围沟槽中，在那里生物膜的形成会引发炎症级联反应，导致结缔组织破坏和骨吸收。临床结果最终取决于宿主细胞和细菌之间的“竞争”。如果成纤维细胞和上皮细胞首先在种植体表面定植并建立稳定的生物密封，细菌附着就会受到阻碍。相反，如果细菌在这场竞争中占优势，生物膜的形成就会变得不可逆，并且对宿主免疫反应和抗菌治疗具有高度抗性。种植体周围炎的微生物病因涉及复杂的多微生物生物膜。它始于放线菌和链球菌物种作为早期定植者，这些细菌会改变局部环境，促进后续定植者的附着。聚合放线菌是一种革兰氏阴性牙周病原体，与侵袭性种植体周围炎特别相关，在失败的种植体周围检测到高流行率。另一种通常与种植体感染相关的病原体是金黄色葡萄球菌，这是一种革兰氏阳性细菌，由于其强大的附着能力和形成强健生物膜的能力，与早期种植体失败有关。因此，有效的策略必须在促进软组织整合和广谱抗菌活性之间找到平衡。已经开发了多种表面改性策略来应对这些挑战，但大多数策略要么侧重于抗菌性能，要么侧重于组织整合。抗菌方法包括装载抗生素、银纳米颗粒或抗菌肽的涂层，以及具有内在抗菌性的聚合物如壳聚糖。虽然这些策略对细菌有效，但它们通常缺乏对宿主细胞的促粘附性能。相反，旨在增强软组织整合的策略则集中在表面拓扑结构修改、增加亲水性以及移植细胞外基质蛋白如纤维连接蛋白或粘附肽如RGD上。尽管这些方法改善了成纤维细胞和角质形成细胞的附着，但它们通常不提供抗菌保护，使种植体容易受到感染。目前种植体表面工程中缺乏同时促进组织整合和防止细菌定植的多功能策略，这是一个重要的空白。解决这一空白需要合理的结构设计——在单一涂层中整合抗菌和促粘附功能——以及能够将实验室验证的结构转化为临床应用过程的先进沉积策略。在这种情况下，逐层（Layer-by-Layer, LbL）组装技术生成的界面显得特别相关，因为它们提供了一个多功能种植体涂层的设计平台，能够应对这一双重挑战。基于相反电荷聚电解质的顺序吸附，LbL组装能够构建具有精确控制的组成、厚度和结构的纳米级薄膜。与共价移植方法不同，LbL可以应用于几乎任何基底几何形状，无需苛刻的化学处理，特别适合复杂的种植体表面。此外，LbL薄膜可以作为生物活性分子的储存库，允许调节释放动力学和持续的生物活性。

LbL方法的一个主要优势是其与多种沉积技术的兼容性，包括浸涂、旋涂和喷雾涂布。值得注意的是，无论采用哪种沉积方法，核心原理都得以保持。在这项研究中，我们调查了两种策略：（i）传统的浸涂，它允许对薄膜结构进行精确控制以便系统优化；（ii）喷雾辅助沉积，它能够在复杂的3D几何形状上快速制备涂层，支持在植入设备上的原位应用，用于预防性和治疗性临床治疗。先前的研究已经强调了单个LbL组分在抗菌或促粘附功能方面的潜力。具体来说，含有30个精氨酸残基的短链聚（L-精氨酸盐酸盐）（PAR30）与透明质酸（HA）结合显示出强烈的抗菌活性。这种效果与促进高多阳离子扩散性的指数生长机制有关，这是薄膜通过膜破坏机制杀死细菌的基础。相反，含有30个精氨酸残基的聚（L-赖氨酸）（PLL30）与纤维连接蛋白（Fn）结合，后者是细胞外基质的关键组分，可以增强成纤维细胞的附着和增殖，同时减少早期细菌附着。然而，将这些组分整合到单一的双功能涂层中，并优化多层结构以同时最大化这两种功能，仍然是一个未探索的领域。本研究检验了两个核心假设：（i）Fn在PLL30/HA多层膜中的空间定位显著影响成纤维细胞的附着，而不损害多阳离子的固有抗菌活性；（ii）优化后的结构可以从浸涂技术成功转化为适合椅旁临床应用的快速喷雾沉积系统。为了验证第一个假设，我们系统比较了在玻璃基底上通过浸涂制备的两种结构配置，以确定最大化Fn表面可及性以促进细胞附着同时保持抗菌效果的最佳策略：（i）插入型Fn结构[(PLL30-HA)2(PLL30-Fn)]4，其中Fn在薄膜厚度中与HA交替；（ii）顶层Fn结构（PLL30-HA）6 + (PLL30-Fn)6，其中Fn被限制在沉积在预组装的（PLL30-HA）6基底上的最外层。选择PLL30而不是多阳离子PAR30，是因为它之前已经验证了与Fn的成功组合，确保了在关键的种植体-牙龈界面处的生物相容性。为了验证第二个假设，通过浸涂研究确定的优化结构被适应到SPARTHA Medical开发的创新双注射器喷雾涂层系统，并在医用级钛合金（Ti6Al4V-ELI）上进行了验证。这项研究首次证明了设计一种单一LbL涂层结构的可行性，该涂层结构能够同时提供抗菌保护，并通过策略性地组合PLL30、HA和Fn在分层多层结构中保持有利于牙龈成纤维细胞附着的表面（图1A）。

图1
浸涂和喷雾涂布组装的示意图。（A）两种涂层设计的浸涂LbL组装。在插入型Fn结构中，首先沉积了两层PLL30-HA，然后是一层PLL30-Fn，重复“2 + 1”序列四次，总共得到12层。在顶层Fn结构中，首先组装了六层PLL30-HA，然后是六层PLL30-Fn。（B）使用SPARTHA Medical的双注射器喷雾系统进行喷雾辅助沉积，同时沉积PLL30（多阳离子，蓝色）与HA（聚阴离子，橙色）或Fn（聚阴离子，红色）。溶液垂直喷洒在水平放置的基底上，使用2.5 mL的PLL30和HA以及1.25 mL的PLL30和Fn。该结构由喷涂的PLL30-HA基底和在其上喷涂的PLL30-Fn组成。此外，这种结构成功地转化为临床相关的钛表面的先进喷雾辅助沉积（图1B）。

材料与方法

涂层材料

人血浆纤维连接蛋白（Fn）通过三步亲和层析法从人血浆中纯化。蛋白质浓度通过280 nm处的UV吸光度确定，消光系数A1% = 12.8。通过SDS-PAGE分析评估纯度约为98%（w/w）。透明质酸钠（HA，分子量100–180 kDa）从Lifecore Biomedical（美国明尼苏达州Chaska）和HTL Biotechnology（法国）购买。聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLLKB30，MW 6300 Da，30个残基）和聚-L-赖氨酸盐酸盐（PLLKC30，MW 4900 Da，30个残基）从Alamanda Polymers（美国阿拉巴马州Huntsville）购买。所有浸涂实验使用PLLKB30，而喷雾涂布实验使用PLLKC30。所有溶液都在无菌过滤（0.22 μm）Tris-NaCl缓冲液（10 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4）中制备。

基底

圆形硼硅酸盐玻璃盖玻片（直径12 mm，厚度0.17 mm）从Thermo Fisher Scientific（美国纽约州New York）获得。医用级钛合金圆盘（Ti6Al4V-ELI，直径9 mm，厚度1 mm，符合ISO 5832-3标准）由Anthogyr SAS（法国Sallanches）提供，表面光洁度（Ra < 0.2 μm）经过机械加工。

逐层（Layer-by-Layer, LbL）组装方法

浸涂组装

评估了两种结构配置（图1A）：（i）顶层Fn结构，（PLL30-HA）6 + (PLL30-Fn)6，基底首先涂覆六层PLL30-HA，然后是六层PLL30-Fn作为顶层。这种配置将Fn限制在最外层。（ii）插入型Fn结构，[(PLL30-HA)2(PLL30-Fn)]4，基底交替涂覆两层PLL30-HA和一层PLL30-Fn，重复“2 + 1”循环四次。这种配置将Fn分布在整个薄膜厚度中。薄膜使用HA和Fn作为聚阴离子，PLL30作为多阳离子，在12 mm直径的玻璃载玻片或用piranha溶液（20% H2O2，20% H2SO4）预处理的硅晶体上构建。所有溶液在Tris-NaCl缓冲液中制备，浓度为0.5 mg mL?1。基底交替浸入多阳离子和聚阴离子溶液中，不同暴露时间：PLL30和HA为5分钟，前三层Fn为15分钟，其余层为8分钟。每次沉积后进行三次1分钟的缓冲液冲洗步骤。组装完成后，样品在室温下风干并储存。

喷雾涂布

使用SPARTHA Medical SAS（法国斯特拉斯堡）开发和专利的双注射器喷雾装置进行喷雾涂布。该系统能够从独立储液器中同时雾化多阳离子和聚阴离子溶液，消除了中间冲洗步骤的需要，将总涂层时间缩短到不到一分钟。PLL30：10 mg mL?1，HA：5 mg mL?1和Fn：1.0 mg mL?1在Tris-NaCl缓冲液中制备。基底安装在使用SolidWorks软件（Dassault Systèmes，法国Vélizy-Villacoublay）设计的定制3D打印载体上，并使用Ultimaker S3 FDM打印机（UltiMaker，荷兰Utrecht）制造。涂层沉积涉及在水平方向的基底上垂直喷洒溶液，喷雾喷嘴与基底之间的距离为10 cm，喷雾装置进行连续的水平直线运动（从左到右再返回），确保均匀覆盖。同时涂覆八个样品。涂覆后的样品在室温下风干并储存，然后进行生物测试。涂层沉积分为两个连续步骤进行，中间没有冲洗或干燥步骤：首先在基底上喷涂2.5 mL的PLLKC30/HA以构建（PLL30-HA）底层，然后喷涂1.25 mL的PLLKC30/Fn以构建（PLL30-Fn）顶层（图1B）。物理化学表征

衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）

ATR-FTIR光谱是使用配备MCT探测器的Tensor 27光谱仪（Bruker，德国曼海姆）记录的。使用了带有45°梯形硅内反射元件（IRE，80 × 10 × 2 mm）的水平ATR附件（HATR，PIKE Technologies，美国威斯康星州菲奇堡）。溶液在氘代Tris-NaCl缓冲液中制备，浓度为0.5 mg mL?1。每种溶液在硅晶体上暴露指定的吸附时间（5至15分钟），然后进行三次缓冲液冲洗（每次1分钟）。光谱是在800–4000 cm?1范围内，以4 cm?1的分辨率，使用Blackman–Harris三项式削波技术获得的平均64次扫描的结果。薄膜生长通过积分酰胺I′带（1600–1700 cm?1）来量化，使用的是OPUS软件版本7.2（Bruker，德国曼海姆）。

石英晶体微天平与耗散（QCM-D）

实时质量沉积和粘弹性特性是通过配备硅涂层石英晶体的Q-Sense E1系统（Biolin Scientific，瑞典哥德堡）监测的。使用前，晶体先用2%（w/v）的Hellmanex溶液清洗（45分钟）和1M HCl溶液清洗（15分钟），然后用超纯水冲洗。聚电解质和蛋白质溶液（在Tris-NaCl缓冲液中浓度为0.5 mg mL?1）以400 μL min?1的流速依次加入，并在中间进行5分钟的缓冲液冲洗。PLL30和HA的沉积时间为5分钟，而Fn的沉积时间则直到晶体稳定。记录了共振频率的变化（?Δfν）和能量耗散（ΔD）。数据基于?Δf3。

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）

在Ti6Al4V-ELI基底上的喷雾辅助多层组装是通过共聚焦激光扫描显微镜（LSM 900，Carl Zeiss，德国）使用荧光标记的组分来评估的。图像是用20倍物镜以顺序扫描模式获取的，以最小化通道间的串扰，并收集了Z堆栈。所有图像都使用ImageJ软件（NIH，美国）进行处理。PLL30是用荧光素异硫氰酸酯（FITC，Sigma-Aldrich，法国圣昆廷-法拉维耶）标记的，遵循已建立的协议。简要来说，PLL30（1 mg mL?1）在新鲜制备的碳酸氢钠缓冲液（100 mM NaHCO3，pH 8.3）中与FITC以1:2的摩尔比混合，在室温下在磁力搅拌下孵育16小时。未反应的染料通过透析（MWCO 3500 Da）去除，使用Tris-NaCl缓冲液（每6小时更换4次，总共更换4次，共48小时）。

原子力显微镜

原子力显微镜（Nanowizard 4，Bruker）用于成像在PBS 0.1 M pH 7.4中至少重新水化2小时的玻璃基底上的浸涂和喷雾涂层的薄膜的厚度和表面形貌，使用的是PEAKFORCE-HIRS-SSB PeakForce Tapping? AFM探针。图像和表面粗糙度使用Gwyddion软件（Gwyddion.net）进行分析。为了考虑涂层表面的异质性，平均粗糙度值（Sa）是从对应于三种不同表面特征的小区域独立提取的：（i）通过划痕暴露的裸露玻璃区域；（ii）较低的涂层区域；以及（iii）聚集特征。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

使用特异性抗体通过ELISA测试Fn及其细胞结合域（CBD）在插入型Fn结构、顶层Fn结构和Fn单层中的可及性。将涂层的玻璃圆盘（直径12毫米）放置在24孔板中，在室温下用含有3%（w/v）奶粉的PBS中封闭1小时。然后在室温下用针对Fn的一抗（F3648 Anti-Fibronectin抗体，由兔子产生，Sigma）或Fn细胞结合域的二抗（sc18825小鼠IgG，Santa Cruz）在PBS + 0.05% Tween? 20 + 1%奶粉中稀释1/1000的溶液中孵育2小时。接着用PBS-Tween? 0.05%（PBST）洗涤三次。随后用二次抗体的抗兔IgG过氧化物酶（NA934，Cytiva）或抗小鼠IgG过氧化物酶（NA931，Cytiva）在PBS + 0.05% Tween? + 1%奶粉中稀释1/5000的溶液中孵育1小时。再用PBST洗涤三次，然后用3.3′.5.5′-四甲基联苯胺（TMB）底物洗涤两次，时间从5分钟到30分钟。反应通过1M硫酸停止，并使用微孔板读数器在450 nm处测量吸光度。

细胞系和培养基

原代人牙龈成纤维细胞（HGF）是从健康的牙龈组织中分离出来的，由UMR1333 Oral Health（法国巴黎城市大学）慷慨捐赠。细胞在含有高葡萄糖（4.5 g L?1，Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中维持，补充了10%（v/v）热灭活的胎牛血清（FBS，Gibco）、1%（v/v）青霉素-链霉素（分别为100 U mL?1和100 μg mL?1，Gibco）和1%（w/v）碳酸氢钠。使用少于10代的细胞进行实验。小鼠Balb/3T3克隆A31成纤维细胞（ATCC CCL-163，ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）在含有高葡萄糖的DMEM中培养，并补充了10% FBS和1%青霉素-链霉素，细胞密度保持在70–80%。所有细胞在37 °C和5% CO2的条件下维持。

细胞代谢活性测定（HGF，24小时）

将浸涂和未涂层的无菌玻璃基底放置在24孔板中。HGF细胞以每平方厘米20,000个细胞的密度接种在完全的DMEM中，并在37 °C和5% CO2下孵育24小时。细胞代谢活性使用resazurin还原测定法（alamarBlue?，Sigma-Aldrich，法国圣昆廷-法拉维耶）进行评估。简要来说，培养基被替换为含有10%（v/v）resazurin试剂的新鲜完全培养基，细胞再孵育3小时。孵育后，将每个孔中的150 μL培养基转移到一个黑色的96孔板中。使用微孔板读数器（激发波长560 nm，发射波长590 nm）测量荧光强度。结果以相对于未涂层基底的相对荧光单位表示。表现出≥70%细胞活力的材料被认为是非细胞毒性的（ISO 10993-5）。

早期细胞粘附测定（Balb/3T3，4小时）和代谢活性测定（Balb/3T3，24小时）在喷雾涂层上

为了评估初始细胞粘附，将Balb/3T3细胞以每样本300,000个细胞的密度滴加在无菌预涂层或未涂层的喷雾玻璃基底上，在37 °C和5% CO2下允许粘附15分钟。随后，向每个孔中轻轻加入含有10%（v/v）resazurin试剂的完全培养基，并再孵育4小时。为了评估细胞粘附和扩散，将Balb/3T3细胞以每样本40,000个细胞的密度接种在无菌预涂层或未涂层的喷雾钛基底上，并在37 °C和5% CO2下孵育24小时。测试了两种条件来评估血清蛋白预处理的效果：（i）直接接种：细胞直接接种在未经预处理的喷雾涂层表面上；（ii）FBS预处理：基底在细胞接种前用FBS预孵育（1小时，37 °C，5% CO2）以模拟生理血清蛋白的吸附。24小时后，培养基被替换为含有10%（v/v）resazurin试剂的新鲜DMEM（alamarBlue?，Sigma-Aldrich），并在37 °C下孵育3小时。代谢活性通过上述方法进行荧光测量。

HGF在浸涂玻璃基底上的形态

在PBS 0.1 M pH 7.4中重新水化至少2小时的玻璃基底上，使用PEAKFORCE-HIRS-SSB PeakForce Tapping? AFM探针，通过原子力显微镜（Nanowizard 4，Bruker）成像浸涂和喷雾涂层的薄膜的厚度和表面形貌。图像和表面粗糙度使用Gwyddion软件（Gwyddion.net）进行分析。为了考虑涂层表面的异质性，平均粗糙度值（Sa）是从对应于三种不同表面特征的小区域独立提取的：（i）通过划痕暴露的裸露玻璃区域；（ii）较低的涂层区域；以及（iii）聚集特征。

细胞系和培养基

原代人牙龈成纤维细胞（HGF）是从健康的牙龈组织中分离出来的，由UMR1333 Oral Health（法国巴黎城市大学）提供。细胞在含有高葡萄糖（4.5 g L?1，Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中维持，补充了10%（v/v）热灭活的胎牛血清（FBS，Gibco）、1%（v/v）青霉素-链霉素（分别为100 U mL?1和100 μg mL?1，Gibco）和1%（w/v）碳酸氢钠。使用少于10代的细胞进行实验。小鼠Balb/3T3克隆A31成纤维细胞（ATCC CCL-163，ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）在含有高葡萄糖的DMEM中培养，并补充了10% FBS和1%青霉素-链霉素，细胞密度保持在70–80%。所有细胞在37 °C和5% CO2的条件下维持。

细胞代谢活性测定（HGF，24小时）

将浸涂和未涂层的无菌玻璃基底放置在24孔板中。HGF细胞以每平方厘米20,000个细胞的密度接种在完全的DMEM中，并在37 °C和5% CO2下孵育24小时。细胞代谢活性使用resazurin还原测定法（alamarBlue?，Sigma-Aldrich，法国圣昆廷-法拉维耶）进行评估。简要来说，培养基被替换为含有10%（v/v）resazurin试剂的新鲜完全培养基，细胞再孵育3小时。孵育后，将每个孔中的150 μL培养基转移到一个黑色的96孔板中。使用微孔板读数器（激发波长560 nm，发射波长590 nm）测量荧光强度。结果以相对于未涂层基底的相对荧光单位表示。表现出≥70%细胞活力的材料被认为是非细胞毒性的（ISO 10993-5）。

早期细胞粘附测定（Balb/3T3，4小时）和代谢活性测定（Balb/3T3，24小时）在喷雾涂层上

为了评估初始细胞粘附，将Balb/3T3细胞以每样本300,000个细胞的密度滴加在无菌预涂层或未涂层的喷雾玻璃基底上，在37 °C和5% CO2下允许粘附15分钟。随后，向每个孔中轻轻加入含有10%（v/v）resazurin试剂的完全培养基，并再孵育4小时。为了评估细胞粘附和扩散，将Balb/3T3细胞以每样本40,000个细胞的密度接种在无菌预涂层或未涂层的喷雾钛基底上，并在37 °C和5% CO2下孵育24小时。测试了两种条件来评估血清蛋白预处理的效果：（i）直接接种：细胞直接接种在未经预处理的喷雾涂层表面上；（ii）FBS预处理：基底在细胞接种前用FBS预孵育（1小时，37 °C，5% CO2）以模拟生理血清蛋白的吸附。24小时后，培养基被替换为含有10%（v/v）resazurin试剂的新鲜DMEM（alamarBlue?，Sigma-Aldrich），并在37 °C下孵育3小时。代谢活性通过上述方法进行荧光测量。

HGF在浸涂玻璃基底上的形态

在无菌基底上使用完全培养基以每平方厘米20,000个细胞的密度接种细胞，并在37 °C和5% CO2下孵育24小时。细胞用4%（w/v）para-formaldehyde溶液（AlfaAesar，美国马萨诸塞州哈弗希尔）在PBS中稀释15分钟进行固定，然后用0.2%（v/v）Triton X-100（Sigma-Aldrich，法国圣昆廷-法拉维耶）在PBS中稀释15分钟进行渗透。非特异性结合位点用0.2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）溶液在含有0.1% Tween? 20（Sigma-Aldrich，法国圣昆廷-法拉维耶）（PBT）的PBS中封闭至少15分钟。样品在PBS中用小鼠单克隆抗vinculin抗体（V9131；Sigma-Aldrich，法国圣昆廷-法拉维耶）稀释1:400在室温下孵育45分钟。在PBS中洗涤3次后，样品在湿度室中用Alexa Fluor? 488山羊抗小鼠IgG二抗（A11029；Invitrogen，美国尤金）稀释1:1000，与Alexa Fluor 568 phalloidin（A12380；Invitrogen，美国尤金）稀释1:400和4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride（DAPI；Sigma-Aldrich，法国圣昆廷-法拉维耶）稀释1:400的混合物孵育1小时，所有这些都稀释在PBT中，从而能够同时观察焦点粘附、细胞骨架的肌动蛋白纤维和细胞核。最后，样品用PBS洗涤3次，用ProLong? Gold（Invitrogen，美国尤金）固定，并用LSM 900共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss，德国耶拿）使用40倍物镜和顺序扫描模式进行检查。Z堆栈使用ImageJ软件（NHI，美国）转换为2D图像。

细菌菌株和培养条件

金黄色葡萄球菌ATCC 25923是从ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的。金黄色葡萄球菌CIP 4.83和Aggregatibacter actinomycetemcomitans DSM 8324分别从“Pasteur研究所收藏”（法国巴黎）和DSMZ-German收藏（德国布伦瑞克莱布尼茨研究所）获得的。细菌菌株在含有30%（v/v）甘醇的培养基中保持在?20 °C。对于实验，细菌在Tryptic Soy Broth（TSB）或Mueller Hinton Broth（MHB）中培养，并在37 °C下振荡培养过夜（16–18小时）。通过测量600 nm处的光密度（OD600）来量化细菌悬浮液。悬浮液在无菌生长培养基或PBS中稀释以达到所需的接种密度。

早期细菌粘附测定（2小时）

将浸涂和未涂层的无菌基底放置在无菌的24孔组织培养板中。将细菌悬浮液（10^6 CFU mL?1在PBS中）加入每个孔中，并在37 °C下静态培养2小时。非粘附的细菌通过轻轻吸出上清液并用无菌PBS溶液洗涤两次去除。粘附的细菌通过将样品放入覆盖有0.9%（w/v）NaCl溶液的新孔板中并在水浴中超声处理10分钟来分离，然后用新鲜的盐水重复两次。将混合悬浮液连续稀释（1:10），并从适当的稀释液中取100 μL样品涂布在TSA板上。在37 °C下孵育24小时后，从含有30–300个菌落的孔中计数菌落形成单位（CFUs）。结果以每平方厘米基底表面的CFU表示。

生物膜形成测定（8小时和24小时）在浸涂基底上

为了评估细菌生物膜的形成，遵循上述相同的程序，只是在超声处理之前，将细菌在2小时后冲洗并更换孔板，然后加入稀释的培养基（10% TSB在PBS中），并在37 °C下静态培养另外6或22小时。通过上述方法进行CFU计数来量化。

生物膜形成测定（24小时）在喷雾涂层上

为了评估喷雾涂层对周围培养基中细菌生长的影响，基底与细菌悬浮液（10^5 CFU cm?2在MHB或TSB中）一起孵育24小时，在37 °C下连续搅拌。孵育后，将每个孔的上清液转移到96孔微孔板中，并通过测量600 nm处的吸光度来量化浮游细菌的生长。结果以归一化的OD600值表示，未涂层的基底作为不受限制细菌生长的阳性对照。

统计分析

所有实验至少进行了三次技术重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。统计显著性是通过使用GraphPad Prism版本9.0（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行单因素方差分析（one-way ANOVA）来评估的。p值<0.05被认为是统计学上显著的。结果和讨论

设计和表征浸涂多层膜

为了设计出同时具备抗菌活性和促进粘附特性的多功能表面涂层，我们整合了两种先前验证过的层状组装（LbL）策略：（i）短链聚阳离子与HA交替排列以赋予抗菌活性，（ii）PLL30与Fn交替排列以限制细菌粘附并促进成纤维细胞附着。核心挑战在于确定这些功能性成分是否可以在不损害其各自生物活性的情况下结合到单一多层结构中，并评估Fn在多层结构中的空间定位如何影响其物理化学性质和生物性能。由于浸涂方法的简单性、可重复性以及对LbL组装的精确控制能力，我们选择了浸涂作为结构优化的方法。这种受控沉积方法使得在转向更复杂的沉积策略之前，能够系统地研究结构变量。在这里，使用玻璃基底作为模型基底。系统研究了两种不同的Fn掺入结构：（i）插层Fn结构，[(PLL30-HA)2(PLL30-Fn)]4，其中Fn在整个膜厚度中与HA交替排列，导致Fn在整个多层膜中均匀分布；（ii）顶层Fn结构，(PLL30-HA)6 + (PLL30-Fn)6，其中Fn仅掺入到预先组装的(PLL30-HA)6基底的上层（图1A）。这两种结构旨在探究多层膜生长行为、Fn的可及性以及功能区室化之间的相互作用。物理化学表征侧重于监测多层膜的构建过程和生长曲线，以了解结构设计如何调节抗菌效果与细胞相容性之间的平衡。多层膜组装和膜生长曲线

膜组装和生长特性是通过衰减全反射-傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱和带耗散监测的石英微天平（QCM-D）来进行的。ATR-FTIR光谱用于通过特征性的酰胺I′（ν(CO)，1600–1700 cm?1）和酰胺II′（N–H弯曲，1500–1600 cm?1）带来监测顺序吸附过程（图1A和B）。每个沉积步骤中酰胺I′强度的逐渐增加证实了两种结构的多层膜构建，其中Fn的吸附量显著高于PLL30或HA，反映了其大量的掺入。图1

多层膜组装和生长曲线。（A和B）LbL膜组装后进行ATR-FTIR分析。在每次沉积PLL30（蓝色）、HA（橙色）和Fn（红色）后，分别获取了（A）插层Fn结构[(PLL30-HA)2(PLL30-Fn)]4和（B）顶层Fn结构（PLL30-HA)6 + (PLL30-Fn)6的谱图。特征性的酰胺I′带（1600–1700 cm?1）证实了在LbL构建过程中聚电解质的掺入。（C和D）在每次沉积PLL30（蓝色）、HA（橙色）和Fn（红色）后，使用QCM-D监测SiO2涂层的石英晶体上的膜构建。展示了（C）插层Fn结构和（D）顶层Fn结构随沉积层数增加的归一化频率偏移（?Δf3）的变化。为了更深入地了解膜生长动力学和质量沉积曲线，进行了QCM-D实验。由于仪器的厚度限制，QCM-D监测仅限于前6–7层。对于这两种结构，都观察到了指数生长动力学（图1C和D），在添加Fn后出现了明显的频率偏移（ΔF）。QCM-D显示的指数生长行为与基于PLL/HA聚电解质的多层膜的良好建立的行为一致，反映了短链PLL30在膜内的高流动性，使其能够“进出”扩散。然而，这两种结构在结构上有所不同。插层Fn结构在12层之前持续显示出酰胺I′信号的逐渐增强，而顶层配置在Fn沉积后显示出较低的酰胺I′带信号进展，这与之前报道的Fn终止膜的亚线性生长行为一致。这些结果可能表明，与文献中报道的线性和指数生长多层膜相比，插层Fn结构可能导致结构更厚且更水化的膜。

然而，总体而言，这些物理化学数据表明，PLL30、HA和Fn可以通过插层和顶层掺入策略成功共组装成多层膜。通过原子力显微镜（AFM）评估的多层膜形貌

AFM分析显示了两种条件下的不同表面形貌（图2）。插层Fn结构（图2A和B）显示出在整个多层膜中分布不规则的大球形聚集体（高度尺度±2 μm）的异质表面。相比之下，顶层Fn结构（图2C和D）表现出更均匀的表面组织（高度尺度±1 μm），特征是更小且分布更均匀的微粒，这可能是由于Fn在最外层表面的限制。聚集体的存在与之前对（PLL-Fn）10涂层的观察结果一致。

图2

通过AFM评估的浸涂多层膜形貌。（A和B）插层Fn结构[(PLL30-HA)2(PLL30-Fn)]4。（C和D）顶层Fn结构（PLL30-HA)6 + (PLL30-Fn)6。使用直径12毫米的圆形玻璃片作为基底。通过独立分析裸露的玻璃划痕区域、较低涂层区域和聚集体特征，展示了涂层结构的平均表面粗糙度（Sa）在补充信息表S1中。两种条件下的玻璃划痕区域显示出一致的Sa值，为10–30 nm。插层Fn结构表现出更大的异质性，纤维状结构的Sa为40至150 nm，聚集体达到150至400 nm，而顶层Fn结构显示出更均匀的轮廓，较低区域的Sa为30至80 nm，聚集体为150至250 nm，反映了涂层内Fn分布的较少异质性。多层膜与人类牙龈成纤维细胞的细胞相容性

Fn在膜内的空间分布可能显著影响其与真核细胞的相容性。在这里，使用人类牙龈成纤维细胞（HGF）评估了（PLL30-HA）6膜、顶层Fn结构和插层Fn结构的细胞相容性，HGF是参与牙齿植入物周围软组织密封的主要细胞。直接接触24小时后，根据Fn的位置观察到了细胞相容性的显著差异（图3A）。

（A）HGF与玻璃基底上浸涂多层膜直接接触24小时后的代谢活性。结果以未涂层玻璃对照的百分比（100%存活率）表示。（*p < 0.05，单因素方差分析）。误差条代表标准偏差。虚线表示70%代谢活性阈值。（B）不同多层膜上培养24小时后的人类牙龈成纤维细胞（HGF）的代表性形态和焦点粘附，这些多层膜用抗vinculin（焦点粘附，黄色）标记，并用DAPI（细胞核，蓝色）和phalloidin（肌动蛋白，洋红色）染色。在顶层Fn结构上可见更多的vinculin层状伪足。比例尺为20 μm。使用直径12毫米的玻璃片作为基底。（PLL30-HA）6涂层显示出与HGF的可接受生物相容性，代谢活性达到未涂层玻璃对照的72%。然而，在顶层Fn结构中添加（PLL30-Fn）6顶层显著增强了细胞相容性至78%（p < 0.05 vs. （PLL30-HA）6）。相反，插层Fn结构[(PLL30-HA)2(PLL30-Fn)]4显示出显著降低的代谢活性（54%，p < 0.05 vs. 顶层Fn结构）。通过vinculin免疫染色研究了细胞形态，它揭示了Fn对细胞形态和焦点粘附形成的明显依赖性（图3B）。在没有Fn的（PLL30-HA）6上的细胞显示出圆形形态，肌动蛋白组织最少，没有显著的焦点粘附。相比之下，两种含Fn的结构都支持细胞扩展，具有典型的延长形态、丰富的肌动蛋白细胞骨架和焦点粘附组装。特别是在顶层Fn配置中，可见更多的vinculin层状伪足形成，与玻璃对照非常相似，而在插层Fn结构中则不明显，这支持了Fn在涂层上的HGF粘附。Fn对细胞焦点粘附的影响已经在促进粘附的（PLL30-Fn）10膜上观察到，其中vinculin不仅分布在细胞质中，还分布在细胞边缘。在这里，vinculin在顶层Fn结构中的分布方式相同。这表明表面暴露的Fn对于成纤维细胞的积极反应是必要的。为了验证这一假设，通过ELISA测定分析了表面可及的Fn和细胞结合域（CBD）位点。ELISA定量表面可及的Fn及其CBD，确认两种结构的Fn和CBD含量显著高于仅吸附Fn的单层（OD450 = 2.78 ± 0.09和2.36 ± 0.07 vs. 1.63 ± 0.03对于Fn；0.4 ± 0.04和0.36 ± 0.04 vs. 0.26 ± 0.04对于CBD，分别对于顶层Fn、插层Fn和Fn单层；平均值±标准偏差）。这证实了多层组装显著丰富了表面的Fn和CBD位点。有趣的是，尽管两种LbL结构之间的CBD可及性相当（OD450 = 0.4 vs. 0.36），但顶层Fn结构中的Fn含量更高。这些观察结果表明，细胞相容性的差异是由整个涂层组织决定的。插层Fn结构的更厚和更水化的轮廓导致基底过于柔软，不利于细胞的最佳反应，这已被证明会损害成纤维细胞在基于PLL/HA的多层膜上的锚定、扩展和增殖。实际上，（PLL30-HA）6单独的适度反应（72%）与此解释一致，而在最外层添加Fn则实现了焦点粘附。此外，AFM分析表明顶层Fn结构显示出更均匀的涂层分布，而插层Fn配置则显示出较大的聚集体和更不均匀的形貌。顶层Fn结构的更均匀表面组织，加上更高的总表面可及Fn，促进了细胞粘附和随后的众所周知的细胞介导的基质重塑，从而有助于观察到顶层Fn配置的改善细胞相容性。多层涂层的抗菌性能：在模拟口腔条件下的早期细菌粘附和生物膜预防

评估了两种结构设计的早期抗菌粘附效果，针对两种临床相关的细菌病原体：金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性）和放线菌素复合体A（革兰氏阴性），这两种细菌都与种植体周围感染有关。在PBS中细菌悬浮液（10^6 CFU mL^-1）暴露2小时后，分别在玻璃基底上检测到金黄色葡萄球菌（3.50 ± 0.54）× 10^3 CFU cm^-2和放线菌素复合体A（6.31 ± 4.09）× 10^3 CFU cm^-2。相比之下，插层Fn和顶层Fn结构都实现了对这两种病原体100%的细菌粘附抑制，在涂层表面上没有检测到粘附的细菌。这种早期的抗粘附性能表明，将Fn掺入PLL30/HA涂层中并不损害由阳离子PLL30赋予的抗菌性能。此外，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的完全抑制反映了广谱的膜破坏机制，而不是由直接的多阳离子与细菌膜接触驱动的物种特异性结合。此外，抗菌效果与Fn的位置无关，两种结构都实现了完全的细菌抑制，表明在初始接触时涂层表面仍有足够的聚阳离子电荷可以与细菌相互作用并使其失活。为了验证这些膜是否适用于生物医学应用，将细胞相容的顶层Fn结构（PLL30-HA）6 + (PLL30-Fn）6通过浸涂方法沉积在临床使用的医用级钛基底（Ti6Al4V-ELI）上，并用稀释的培养基（10% TSB在PBS中）中的金黄色葡萄球菌进行挑战，以模拟体内条件下的有限营养供应。在8小时和24小时时评估了细菌粘附和生物膜形成（图4）。未涂层的钛基底在8小时后显示出从（5.76 ± 2.86）× 10^3 CFU cm^-2增加到24小时后的（4.79 ± 0.11）× 10^4 CFU cm^-2的显著细菌定植。相比之下，涂层的钛在两个时间点都实现了细菌粘附和生物膜形成的完全抑制。图4

在模拟口腔条件下的钛表面上，浸涂顶层Fn结构的抗粘附和抗生物膜性能。在8小时和24小时与金黄色葡萄球菌在稀释培养基（10% TSB在PBS中）接触后，通过CFU计数量化了生物膜的形成。未涂层的钛基底在8小时后显示出（5.76 ± 2.86）× 10^3 CFU cm^-2的细菌定植，而在24小时后增加到（4.79 ± 0.11）× 10^4 CFU cm^-2。相比之下，涂层的钛在两个时间点都实现了细菌粘附和生物膜形成的完全抑制。图4顶层Fn架构能够独立于底层基底保持强大的抗菌活性，这一事实表明其抗菌机制依赖于涂层的多阳离子可及性，而非基底依赖性的聚电解质吸附行为。在模拟口腔环境的条件下，这些多阳离子在涂层表面可保持长达24小时。这些发现揭示了两种架构之间的关键功能不对称性：虽然插层Fn和顶层Fn架构都能提供等同的抗菌保护，但只有顶层Fn配置成功地在抗菌性和细胞相容性之间取得了平衡。这种差异反映了抑制细菌和细胞粘附所需的分子要求的不同。细胞粘附需要涂层表面具有空间可及性的Fn，而抗菌活性则依赖于PLL30在薄膜内的“进出”扩散来破坏细菌膜，无论Fn的位置如何。这种功能不对称性指导了我们选择顶层Fn架构（PLL30-HA）+（PLL30-Fn）6用于喷雾涂层开发。

尽管浸涂为系统工程化双功能PLL30/HA/Fn层状（LbL）界面提供了一个强大且可控的平台，但其在实际牙科应用中的使用受到限制。具体来说，浸涂过程特有的长时间组装和植入物多次浸入溶液的特性，与现场或椅旁临床使用不兼容。因此，我们探索了替代的沉积策略，以开发一种快速、适用于椅旁的涂层技术，从而改变种植体周围炎的管理方式，使用了SPARTHA Medical开发的便携式双注射器喷雾装置（方案1B）。该系统允许从独立储液器中同时雾化多阳离子和聚阴离子溶液，从而消除了中间冲洗步骤，将总涂层时间缩短至不到1分钟。喷雾辅助沉积确实可以用于预防种植体周围炎，通过在手术放置前沉积涂层来提供抗菌保护，以应对早期愈合阶段的脆弱性，或者作为已经放置的种植体周围炎的现场治疗手段，此时涂层沉积必须直接在口腔中进行，无需移除装置。从浸涂到现场适用喷雾沉积的转变的重要性在于，它可以在临床环境中重新应用涂层，以克服几个问题，例如（i）植入物放置过程中机械应力导致的涂层侵蚀，或（ii）涂层随时间的降解。然而，从浸涂到喷雾沉积的转变证明是具有挑战性的。喷雾沉积在根本不同的动力学条件下进行，例如在短暂接触期间发生的聚电解质吸附，以及在基底界面处的快速蒸发。薄膜的形成更可能受到组分浓度和电荷比的影响。实际上，使用为浸涂优化的聚电解质和Fn浓度（0.5 mg/mL）进行的初步实验产生了高度可变的抗菌性能。通过相同喷雾过程在钛表面上涂层的细菌抑制率从20%到99%不等，表明样品间的多阳离子沉积不足。系统性的浓度优化实现了具有稳定抗菌性能的薄膜形成：PLL30 10 mg/mL（比浸涂增加了20倍）；HA 5 mg/mL（增加了10倍）和Fn 1.0 mg/mL（增加了2倍）。这些浓度与之前使用相同双注射器喷雾系统的研究结果一致，该研究确定了针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的可重复抗菌涂层的最佳配方。

喷雾涂层在钛表面上的可视化

喷雾涂层沉积过程中两种聚电解质溶液的同时雾化，排除了通过QCM-D和ATR-FTIR逐步监测薄膜组装的过程。为了确认双功能涂层的成功沉积及其组分的分布，我们使用共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss）和荧光标记的PLL30-FITC（青色）以及Fn-Alexa568（红色）对喷雾辅助的多层薄膜进行了可视化。共聚焦图像确认了涂层在钛表面上的成功沉积，整个基底上覆盖均匀（图5）。Fn的分布显示与PLL30共定位，但表现为离散的聚集体，而不是连续的层。这种Fn的聚集行为与之前在浸涂LbL组装的Fn薄膜中的观察结果一致。

图5

共聚焦激光扫描显微镜图像显示了在钛基底上喷涂的（PLL30-HA）+（PLL30-Fn）0.5 mg/mL薄膜。（A）PLL30通道（青色），（B）Fn通道（红色），（C）钛基底地形，以及（D）显示PLL30和Fn共定位的合并图像。比例尺：10 μm。使用直径为9毫米的Ti圆盘作为基底。值得注意的是，底层的钛地形特征（表面条纹）并未影响涂层的组织结构。在整个表面上观察到PLL30和Fn的均匀分布，没有沿着底层条纹模式对齐，表明这种涂层可以不受基底影响地均匀施加。由于涂层厚度低于z堆栈分析的分辨率限制，因此无法通过共聚焦显微镜进行量化。这与观察结果一致，即喷雾涂层比浸涂涂层更薄。

通过AFM评估的多层地形

对玻璃基底上喷涂沉积的SPR（PLL30-HA）2.5 mL +（PLL30-Fn）1.25 mL涂层进行的AFM分析也确认了薄膜的成功形成，其表面特征和聚集体与浸涂的顶层Fn架构相当（图6）。将喷雾涂层浸泡在PBS中7天后，确认了薄膜的结构完整性，与第1天的相同涂层相比，没有出现分层或表面形态损失，提供了在生理条件下涂层稳定性的初步证据（数据未显示）。这些结果与最近使用相同双注射器喷雾装置对医疗级钛上喷涂沉积的PAR30/HA聚电解质涂层进行的FIB-SEM横截面分析和表征的研究结果一致。尽管该研究中的多阳离子组分（PAR30）与本工作中的（PLL30）不同，但两种系统都依赖于相同的静电LbL组装机制、相同的双注射器喷雾装置和相同的HA聚阴离子，这支持了在Ti基底上进行这些厚度测量的相关性。喷涂沉积的涂层显示出一致的平均粗糙度（Sa）：玻璃Sa = 10–20 nm，较低涂层区域的Sa = 150–200 nm，以及聚集体的较高Sa为550–650 nm（SI表S1），这反映了喷雾辅助沉积与浸涂架构相比的快速复合动力学。图6

2D和3D AFM地形显示了喷涂的（PLL30-HA）+（PLL30-Fn）薄膜。比例尺：10 μm。使用直径为12毫米的圆形玻璃载玻片作为基底。评估了喷涂涂层钛的细胞相容性

使用Balb/3T3成纤维细胞评估了细胞相容性，这是一种常用的生物相容性测试标准细胞系，因其稳健性和标准化反应而被选用于喷涂涂层验证，便于协议优化。在喷涂涂层优化过程中，我们发现聚电解质反离子化学显著影响喷涂沉积薄膜的细胞相容性，但对浸涂薄膜则没有影响。PLLKB30在喷涂条件下产生了细胞毒性表面，而PLLKC30产生了细胞相容性涂层（SI图S1）。这种差异可能源于喷涂沉积过程中缺乏冲洗步骤，导致反离子（如溴化物）的保留，这些反离子可能引起细胞毒性。因此，所有后续的喷涂涂层实验都使用了PLLKC30。通过使用4小时粘附测定法对喷涂涂层玻璃盖玻片进行初步细胞相容性筛选来评估早期成纤维细胞的反应。当包含末端Fn（SPR（PLL30-HA）+（PLL30-Fn））时，喷涂涂层样品支持细胞存活并显示出更高的代谢活性，达到了85%，而不含末端PLL30/Fn的涂层仅为63%（p < 0.05）（图7A）。这种反应特征与浸涂薄膜观察到的细胞反应相似，其中包含末端PLL30/Fn的层同样增强了细胞粘附。这表明喷雾组装的PLL30/HA薄膜保留了浸涂薄膜所具有的水合涂层特性，并且暴露在表面的Fn通过提供可访问的整合素结合位点来补偿这种水合。图7

喷涂涂层玻璃和钛基底的细胞相容性。（A）成纤维细胞在喷涂涂层玻璃基底上直接接触4小时后的早期反应，无论是否含有末端PLL30/Fn。含有Fn的薄膜显示出比不含Fn的涂层更高的反应。（B）成纤维细胞在与喷涂涂层钛基底直接接触24小时后的代谢活性，无论是否预先用FBS孵育。结果相对于未涂层对照组（100%）进行了标准化（*p < 0.05，单因素ANOVA）。误差条代表标准偏差。虚线表示70%的代谢活性阈值。使用直径为12毫米的圆形玻璃载玻片和直径为9毫米的Ti圆盘作为基底。这些结果证实，使用PLL30（10 mg/mL）、HA（5 mg/mL）和Fn（1 mg/mL）的浓度进行喷涂涂层过程本身可以产生细胞相容性涂层，且无需中间冲洗。因此，通过在喷涂涂层和未涂层钛基底上接种成纤维细胞并培养24小时来评估细胞存活率。为了模拟种植体周围环境，其中植入物与富含蛋白质的血清和牙龈液接触，这些蛋白质会自发吸附在植入物表面，涂层基底在细胞接种前用胎牛血清（37°C下1小时）进行了预处理。这种预处理显著提高了细胞存活率。在这些优化条件下，喷涂涂层钛基底在24小时培养后细胞存活率从45%提高到了88%（图7B），接近未涂层钛基底的存活率。喷涂涂层钛的抗菌性能

喷涂涂层钛基底与金黄色葡萄球菌（S. aureus）和放线菌（A. actinomycetemcomitans）接触24小时。评估了周围介质中的浮游细菌生长和表面相关的生物膜形成。与未涂层钛基底相比，喷涂涂层表面显著减少了浮游细菌的生长，这通过周围介质中的较低光密度值（OD600）得到证实（图8A）。图8

喷涂钛的抗菌性能。（A）喷涂涂层钛基底与S. aureus和A. actinomycetemcomitans接触24小时后的浮游细菌生长，相对于未涂层钛基底（100%生长）进行了标准化。（B）通过CFU计数量化了未涂层钛和喷涂涂层钛基底上的S. aureus和A. actinomycetemcomitans生物膜的形成。误差条代表标准偏差。使用直径为9毫米的Ti圆盘作为基底。此外，喷涂涂层基底对两种病原体的表面相关生物膜形成表现出强烈的抑制作用。对于S. aureus，观察到生物膜形成的显著减少，而对于A. actinomycetemcomitans则实现了完全抑制（图8B）。总体而言，浮游生长和表面生物膜形成的同时抑制表明，转换为临床适用的喷雾辅助沉积保留了足够实现强抗菌性能的多阳离子移动性，尽管构建方法与浸涂方法有很大不同。结论

在这项研究中，我们证明了通过结构控制可以合理设计结合抗菌和细胞相容性功能的双功能多层涂层，并成功将其从浸涂技术转化为快速、临床适用的喷雾沉积。通过在逐层组装中结合短链多阳离子（PLL30）、透明质酸（HA）和纤维连接蛋白（Fn）（方案1A），我们确定了Fn的空间定位对于双重功能至关重要：将Fn限制在顶层——顶层Fn架构（PLL30-HA）+（PLL30-Fn）6——既保持了抗菌活性，又保持了细胞相容性，而将Fn分布在整个薄膜中则会损害细胞粘附，尽管对细菌粘附的抑制效果相同。这项工作的核心成就是将这种浸涂架构成功转化为使用SPARTHA Medical开发的双注射器喷雾装置的创新喷雾辅助沉积（方案1B），将涂层组装时间从几小时缩短到不到1分钟。这种转化需要全面的重新优化，但能够在医疗级钛基底上保持双功能性能。喷雾辅助快速沉积的临床影响是显著的。它可以在两种情况下应用：在手术放置前立即对无菌植入物进行预防性涂层，以及在种植体周围炎治疗期间进行潜在的现场治疗性应用，无需移除装置，从而将实验室概念转化为一种实用的、适用于椅旁的平台，用于预防性和治疗性管理种植体周围炎。基于这一转化基础，未来的研究将在先进的3D和共培养模型中评估喷涂涂层双功能系统，然后进行体内评估，同时缩小沉积装置的尺寸以实现完全的椅旁集成。作者贡献

AG、EP、NEV和PL参与了研究的构思和监督。DS参与了抗菌活性的设计。RC参与了细胞牙龈反应的开发。GS、DS、RC、LM、YL、CC、RA和GF参与了实验。NC参与了钛的供应和表征。GS进行了统计分析。GS和AG撰写了手稿的初稿。所有作者都参与了手稿的修订工作，并阅读并批准了最终提交的版本。利益冲突

无需要声明的利益冲突。数据可用性

本文的数据，包括原始实验数据、抗菌测试结果以及浸涂层的表征（ATR-FTIR、QCM-D），均可在Zenodo平台上获取，网址为：https://doi.org/10.5281/zenodo.18788944。补充信息（SI）也可获取，详见DOI：https://doi.org/10.1039/d6bm00291a。致谢

作者感谢法国国家研究署（ANR）通过BioImTiTis ANR项目提供的资助，并感谢联盟成员之一Anthogyr的Anne-Lise Chopard-Lallier提供并准备了本研究中使用的钛基底。作者还感谢法国巴黎城市大学（Université Paris Cité）UMR1333口腔健康团队的Caroline Gorin，她分离并慷慨捐赠了原代人牙龈成纤维细胞（HGF）。作者同时感谢法国斯特拉斯堡INSERM的Bernard Senger，他对浸涂层薄膜的QCM-D表征工作做出了贡献，并在QCM-D数据分析中提供了帮助。作者还要感谢位于CY Cergy-Paris大学旗下的“Microscopies & Analyses”成像设施，该设施提供了共聚焦显微镜技术支持。此外，作者还感谢意大利那不勒斯Vanvitelli大学的Valentina Sorvillo，她在制作本文的示意图方面给予了协助。参考文献