马体内自然感染马丁尼加利什曼原虫的分子与寄生虫学证据

《International Journal for Parasitology》：Molecular and parasitological evidence of Leishmania (Mundinia) martiniquensis infection in a horse from Brazil

　　

马丁尼加利什曼原虫（Leishmania (Mundinia) martiniquensis）是一种新发人类病原体，其在家畜中的感染报道日益增多。本研究描述了巴西一匹无国际旅行史的母马自然感染病例，该马表现为持续性结节性皮肤病变和颈部淋巴结肿大，且无全身受累迹象。考虑到研究区域皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis, CL）和内脏利什曼病（visceral leishmaniasis, VL）的流行情况，以及先前关于马利什曼病的报道，研究人员最初怀疑是婴儿利什曼原虫（Leishmania (Leishmania) infantum）感染。间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay, IFAT）检测到抗L. (L.) infantum抗体（滴度320），淋巴结组织病理学分析显示有无鞭毛体（amastigote）形态，符合利什曼原虫属（Leishmania spp.）特征。因此，在病因尚未明确的情况下，基于最初对L. (L.) infantum感染的怀疑，在诊断调查期间使用长须罗蛉（Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis）进行了异源诊断（xenodiagnosis）。观察到有限的吸血现象，且未检测到寄生虫传播的证据。此外，从颈部淋巴结细针穿刺活检中分离出体外培养的鞭毛状寄生虫。通过对临床样本和培养分离株进行利什曼原虫属动质体DNA（kinetoplast DNA, kDNA）和锥虫科核糖体DNA内转录间隔区1（internal transcribed spacer 1, ITS1）区域的扩增，随后进行桑格测序（Sanger sequencing），揭示了马丁尼加利什曼原虫的存在。这些发现提供了巴西马体内自然感染马丁尼加利什曼原虫的文献证据，并强调了这种新发病原体在皮肤利什曼病和内脏利什曼病流行区域的传播。此外，它们强化了需要进一步研究以阐明其流行病学循环和媒介-宿主相互作用的必要性。

论文解读

研究背景与意义

利什曼原虫属（Leishmania）是一类古老的人畜共患寄生虫，目前被划分为四个亚属：利什曼亚属（Leishmania）、维亚尼亚亚属（Viannia）、蒙迪尼亚亚属（Mundinia）和蜥蜴利什曼亚属（Sauroleishmania）。其中，蒙迪尼亚亚属（Mundinia）作为一个较新的分类单元，包含了多种近年来才被描述的物种，且至少有三种被认为对人类具有致病性，包括马丁尼加利什曼原虫（Leishmania (Mundinia) martiniquensis）。该物种最早于1995年从马提尼克岛的一例人类皮肤利什曼病（CL）病例中分离出来，随后在泰国的人类内脏利什曼病（VL）病例中也发现了它的踪迹。

尽管马丁尼加利什曼原虫的生命周期被认为与其他利什曼原虫相似，但其流行病学循环中的关键环节——如自然储水池、宿主易感性和传播动力学——仍知之甚少。传统的观念认为，白蛉（Phlebotomine sand flies）是利什曼原虫的主要传播媒介，但近期研究表明，蒙迪尼亚亚属的某些物种可能具有独特的媒介关系，例如蠓类（biting midges）也可能参与其传播。除了人类感染，该病原体在家畜中的检出也日益受到关注，特别是在马类中，已有多个新旧大陆国家的报告。然而，马类在利什曼原虫传播循环中的流行病学意义仍不明确。在巴西，直到2023年才首次在里约热内卢州的一匹母马体内分离出该病原体，这凸显了在该国进一步研究其地理分布、潜在宿主和传播媒介的紧迫性。本研究正是基于此背景，旨在通过多学科手段确认巴西米纳斯吉拉斯州一起马类自然感染病例，并探讨其流行病学意义。该研究发表于《International Journal for Parasitology》。

关键技术方法

研究人员采用了一系列互补的诊断技术对病例进行全面分析。首先，通过兽医临床检查评估患马的整体健康状况及血液生化指标。其次，采集了全血、血清、结膜拭子（conjunctival swab, CS）、颈部淋巴结（lymph node, LN）及皮肤活检等多种生物样本。寄生虫学诊断方面，进行了组织病理学检查（hematoxylin and eosin染色）和体外培养（Schneider培养基）。血清学诊断采用了间接免疫荧光试验（IFAT）检测抗L. (L.) infantum抗体。分子生物学诊断是本研究的核心，包括对利什曼原虫动质体DNA（kDNA）和锥虫科核糖体DNA内转录间隔区1（ITS1）区域的PCR扩增，以及对阳性扩增产物的桑格测序（Sanger sequencing）和系统发育分析（phylogenetic analysis）。此外，研究还创新性地使用了长须罗蛉（Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis）进行了异源诊断（xenodiagnosis）实验，以评估媒介的感染潜力。

研究结果

病例呈现与临床检查

研究对象为一匹四岁的怀孕夸特马（Quarter Horse）母马，来自巴西米纳斯吉拉斯州的Abadia dos Dourados市。该马右耳廓出现持续性皮肤病损，并伴有颈部淋巴结肿大，病程约两个月且难以愈合。患马无国际旅行史，同群其他马匹未见类似症状。临床血液学和生化参数均在正常参考范围内。

寄生虫学与血清学诊断

组织病理学检查在颈部淋巴结活检样本中观察到了利什曼原虫无鞭毛体（amastigote）形式。体外培养成功从淋巴结细针穿刺（fine-needle aspiration, FNA）样本中分离出前鞭毛体（promastigote），但血液培养为阴性。血清学检测显示抗L. (L.) infantum抗体滴度为320。

分子生物学诊断

尽管kDNA-PCR和ITS1-PCR在淋巴结样本中均检测出利什曼原虫DNA，但在血液、结膜拭子和外观正常的皮肤样本中均为阴性。桑格测序和系统发育分析最终确认，淋巴结样本及其体外培养分离株的序列与马丁尼加利什曼原虫的参考序列高度相似（一致性超过99%），从而确诊为该物种感染。

异源诊断

使用55只长须罗蛉雌虫进行异源诊断，仅有3只（5.45%）成功完成吸血。对这些雌虫的解剖和分子检测均未发现利什曼原虫感染的证据，表明在此次实验中未发生寄生虫传播。

讨论与结论总结

本研究的讨论部分指出，这是巴西第二次报道马丁尼加利什曼原虫感染，也是米纳斯吉拉斯州的首次记录。与以往报道一致，患马主要表现为皮肤病变和局部淋巴结肿大，无全身症状。研究强调了淋巴结作为检测该病原体的重要样本来源，因为血液、结膜拭子和正常皮肤样本的PCR结果均为阴性。

关于异源诊断的阴性结果，研究人员认为这可能归因于两个因素：一是长须罗蛉对马的厚皮肤穿透困难，导致吸血率极低；二是长须罗蛉本身可能对马丁尼加利什曼原虫具有抗感染性，这与之前关于蒙迪尼亚亚属物种在其他白蛉种类中发育受限的实验结果相符。此外，由于当时实验室仅能提供长须罗蛉，未来研究应考虑使用蠓类等其他潜在媒介进行实验。

结论部分重申，本研究通过寄生虫学、血清学和分子方法确诊了一例由马丁尼加利什曼原虫引起的马利什曼病（equine leishmaniasis, EL）。这是巴西第二例本土马感染该物种的记录，证实了这一新发人类病原体在皮肤及内脏利什曼病流行区的传播。尽管异源诊断未发现长须罗蛉被感染，但由于吸血率低，该结果需谨慎解读。研究最后呼吁进一步开展工作，以阐明马类在流行病学中的作用以及马丁尼加利什曼原虫的传播动力学。