《JACC: Heart Failure》：Donor-Derived Cell-Free DNA as a Prognostic Biomarker After Heart Transplantation
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心脏移植（HT)术后，供体来源游离DNA分数(dd-cfDNA%)与供体量评分(DQS)的检测已成为急性排斥反应的无创生物标志物。然而，其在组织病理学之外的预后价值尚不确定。DEFINE-HT（心脏移植中无创游离DNA替代有创活检的开发）研究为一项前瞻性、多中
心脏移植（HT)术后，供体来源游离DNA分数(dd-cfDNA%)与供体量评分(DQS)的检测已成为急性排斥反应的无创生物标志物。然而，其在组织病理学之外的预后价值尚不确定。DEFINE-HT（心脏移植中无创游离DNA替代有创活检的开发）研究为一项前瞻性、多中心、观察性、纵向队列研究，纳入美国10个移植中心的成人心脏移植受者，随访移植术后1年，在常规监测及因需评估时采集血液进行dd-cfDNA检测（Prospera Heart检测），检测独立于临床决策。主要复合终点为术后1年内发生的治疗性排斥反应、移植物功能障碍、再次移植或死亡。研究共纳入110例患者（中位年龄55岁，女性25.5%，黑人22%），38例(34.5%)达到主要复合终点：治疗性排斥反应(20%)、移植物功能障碍(10.9%)、死亡(3.6%)及再次移植(0%)。心内膜活检(EMB)中4.6%显示排斥反应，90%的dd-cfDNA结果低于阈值。治疗性排斥反应与未治疗活检阳性排斥相比，dd-cfDNA%与DQS均更高（0.23% vs 0.085%；P=0.045；27 vs 9 copies/mL；P=0.012）。移植物功能障碍患者中尽管dd-cfDNA升高，但无心内膜活检阳性排斥。dd-cfDNA%与DQS每增加一个患者内标准差，主要终点风险分别增加19%和12%（P<0.001）。高于阈值的dd-cfDNA水平使复合终点风险增加4.42倍（P<0.001）。DEFINE-HT研究支持dd-cfDNA作为移植物健康预后生物标志物的潜在作用，并为比较dd-cfDNA与基于活检的监测策略的随机对照试验——ACES-EMB（心脏移植患者游离DNA与心内膜活检排斥监测比较有效性研究，NCT06414603）提供依据。
心脏移植作为终末期难治性心力衰竭的确定性治疗手段，全球每年实施数千例手术，仅美国每年即超过4,500例。尽管免疫抑制方案和术后管理不断改进，仍有20%~25%的受者在移植术后第一年内发生急性排斥反应，另有一部分患者在无组织学排斥证据的情况下出现移植物功能障碍。排斥反应监测因此成为移植术后管理的基石，但长期以来依赖的心内膜活检(EMB)存在操作有创、诊断阳性率低、观察者间变异以及无法捕捉生物学层面隐匿但具有临床意义的移植物损伤等局限性。在此背景下，供体来源游离DNA(dd-cfDNA)作为敏感的无创排斥反应生物标志物应运而生，多项研究已验证dd-cfDNA分数(dd-cfDNA%)在辅助EMB诊断中的优良性能。近年，dd-cfDNA绝对定量即供体量评分(DQS，单位copies/mL)的应用进一步补充了分数检测的不足，通过缓解受者cfDNA波动对计算结果的干扰，提升了诊断准确性。然而，既往研究几乎仅限于探讨dd-cfDNA与活检定义排斥反应的相关性，其对于以患者为中心的治疗性排斥反应、移植物功能障碍或生存等临床结局的预测价值，以及dd-cfDNA在活检阴性事件或临床未予治疗组织学排斥反应中的意义，尚缺乏深入研究。
为填补上述空白，研究人员开展了DEFINE-HT（心脏移植中无创游离DNA替代有创活检的开发）研究。该研究采用前瞻性、多中心、观察性、纵向队列设计，在美国10个移植中心纳入成人心脏移植受者，于移植术后1年内系统采集近1,100份dd-cfDNA样本，并将其与临床裁定的结局事件相关联，旨在将dd-cfDNA的应用从诊断辅助工具拓展为移植物健康的预后生物标志物。研究假设dd-cfDNA不仅能够识别活检定义的排斥反应，还能区分具有临床干预价值的排斥反应与单纯组织学异常事件、检测无组织学证据的移植物功能障碍，并为不良结局提供动态风险分层。
研究人员从2022年12月1日至2023年9月30日期间入组，最终110例完成移植且符合纳入标准的患者构成分析队列。该队列中位年龄55岁，男性占74.5%，60%为白种人，主要移植指征为非缺血性心肌病(63.6%)。供体中位年龄34岁，73.6%为脑死亡后捐献，62.7%采用静态冷保存。研究队列特征与同期美国科学移植注册系统(SRTR)数据库中10,298例受者及供体相比无显著差异，具有良好代表性。
研究的主要技术方法包括：采用商业化Prospera Heart检测平台（Natera公司）定量检测血浆dd-cfDNA%和DQS；通过Jeffrey共轭先验法进行贝叶斯样本量规划；运用贝叶斯高斯混合模型拟合dd-cfDNA纵向轨迹，采用四阶正交多项式拟合时间效应并设定患者水平的随机截距与斜率；以Kaplan-Meier法估计事件无生存；采用Andersen-Gill比例风险模型评估时变dd-cfDNA与临床事件的关联，该模型允许个体内复发事件，Wei-Lin法估计稳健标准误，以Wald检验推导置信区间和P值；dd-cfDNA既作为标准化至患者内标准差的连续变量，也按阈值（≥0.26%和/或≥18 cp/mL）二分类为"升高"与"未升高"，采用末次观测值向后推移法处理测量间隔期的暴露状态。
研究结果部分呈现如下：
主要复合终点及其组分：移植术后1年，38例(34.5%)患者达到治疗性排斥反应、移植物功能障碍、再次移植或死亡的主要复合终点，95%置信区间为26.0%-43.5%。其中治疗性排斥反应为首发事件者22例(20.0%)，移植物功能障碍12例(10.9%)，死亡4例(3.6%)，无再次移植病例。11例患者经历不止一种终点事件，事件间中位间隔26天。所有死亡发生在移植术后1个月内（中位10天），死因包括原发性移植物功能障碍(3例)和肠缺血(1例)，均与排斥反应无关。
治疗性排斥反应与心内膜活检特征：879例次EMB中，94.7%为监测性活检，活检阳性排斥反应40例次(4.5%)，其中急性细胞排斥反应(ACR)17例次、抗体介导排斥反应(AMR)22例次、混合排斥反应1例次。25例次(62.5%)活检阳性排斥获得治疗，以ACR 2R级为主(16例)；15例次未治疗者主要为无人类白细胞抗原供体特异性抗体(HLA DSA)的pAMR1(I+)或pAMR1(H+)病变。此外，2例次活检阴性排斥经临床判定后予以治疗。
dd-cfDNA与急性排斥反应：研究人员将dd-cfDNA水平在临床稳定患者、未治疗活检阳性排斥患者及治疗性排斥患者三组间进行比较。治疗性排斥患者的dd-cfDNA%中位数(0.23%)和DQS中位数(27 cp/mL)均显著高于未治疗活检阳性排斥患者（dd-cfDNA% 0.085%，P=0.045；DQS 9 cp/mL，P=0.012），但未治疗活检阳性排斥组与临床稳定组相比无统计学差异。双变量分布显示，12例未治疗活检阳性排斥中9例低于双阈值，而所有3例DSA阳性的pAMR病例均高于阈值。
dd-cfDNA与移植物功能障碍：769例次超声心动图检查中，18例患者出现移植物功能障碍（左心室射血分数LVEF中位44%）。13例合并配对EMB的移植物功能障碍患者中，无1例存在活检阳性排斥。5例(38%)双变量检测结果高于阈值；功能障碍时对应dd-cfDNA%中位数0.12%，DQS中位数14 cp/mL。随访期末，12例LVEF改善，6例持续功能障碍。
dd-cfDNA与临床结局的时变关联：Andersen-Gill模型分析显示，dd-cfDNA升高状态与主要复合终点风险显著相关，未校正风险比(HR)为4.42（95%置信区间：1.99-9.80，P<0.001），校正年龄、性别、种族及移植前致敏状态后仍保持显著（HR：4.37，95%置信区间：2.01-9.49，P<0.001）。以患者内标准差衡量，dd-cfDNA%每增加1个标准差(Δ0.09%)，主要终点风险增加19%（HR：1.19，P<0.001）；DQS每增加1个标准差(Δ6 cp/mL)，风险增加12%（HR：1.12，P<0.001）。亚组分析显示，治疗性排斥反应风险分别增加15%和10%（P=0.075和P=0.071，边缘显著），移植物功能障碍风险分别增加23%和14%（均P<0.001）。
讨论部分，研究人员首先指出DEFINE-HT研究证实dd-cfDNA不仅是诊断辅助工具，更具预后生物标志物价值。关键发现包括：第一，活检阳性但未治疗排斥（尤其无DSA的pAMR1）患者的dd-cfDNA水平低，而治疗性排斥显著升高，表明dd-cfDNA与临床干预决策高度一致，可用于组织学发现的临床情境化解读，筛选真正需要干预的病例；第二，dd-cfDNA在无活检证实排斥的移植物功能障碍中仍可升高，提示其识别组织学隐匿性损伤的能力，与既往将dd-cfDNA与移植肾内基因表达相关联的研究结论一致；第三，dd-cfDNA提供动态预后风险分层，时变模型显示阈值以上水平及患者内升高均与不良结局风险增加相关，不仅是横断面风险标志，更反映纵向变化轨迹；第四，基于双阈值（0.26%和18 cp/mL）90%以上检测结果低于阈值，结合本研究EMB低诊断阳性率，提示在低风险患者中安全减少监测性活检的可行性，从而减轻有创操作的负担、风险和费用。
研究人员将本研究与现有文献比较，指出当代心脏移植1年排斥反应发生率15%~25%与本研究20%的治疗性排斥率相符。DEFINE-HT中位8次/例EMB绝大多数为监测性目的，但仅少数检出免疫组织病理学排斥，且约40%活检阳性者未予治疗，质疑了频繁监测性EMB的必要性。未治疗排斥多为既往已治疗AMR恢复期或无HLA DSA的pAMR1病例，后者单独存在时对长期预后影响有限。除原发性移植物功能障碍外，16%患者术后首年出现新发移植物功能障碍，多无活检阳性排斥但伴dd-cfDNA升高，支持dd-cfDNA对组织学隐匿性损伤更高的敏感性，也与dd-cfDNA与移植器官内基因表达相关性高于其与组织病理学相关性的发现一致。不过，部分移植物功能障碍患者dd-cfDNA未升高，提示可能存在非免疫性损伤机制。
关于DQS，研究人员注意到其作为较新概念，通过量化dd-cfDNA绝对浓度减少受者cfDNA波动的影响。本研究中dd-cfDNA%从第4月起渐升而DQS保持平稳，推测与免疫抑制剂浓度变化及白细胞脆性相关。肾移植中dd-cfDNA%与DQS联合应用可降低假阳性率，心脏移植中亦有类似发现。
研究局限性包括观察性设计、依赖当地病理和影像而无中心实验室、各机构监测方案未标准化、dd-cfDNA结果事后提供临床团队以减少决策影响、复合终点包含免疫与非免疫事件、早期死亡非排斥相关、无再次移植事件，以及末次观测值向后推移法在测量间隔较长或快速变化时可能错分暴露状态等。尽管如此，多中心设计、大量连续样本及以患者为中心的终点仍支持结果的普适性。DEFINE-HT的发现直接推动了正在进行中的ACES-EMB随机对照试验(NCT06414603)，该试验将比较dd-cfDNA监测与EMB监测的临床结局，验证dd-cfDNA能否安全减少有创监测同时保护移植物预后。
研究结论翻译如下：在这项多中心前瞻性队列研究中，dd-cfDNA%和DQS的升高与心脏移植术后首年内治疗性排斥反应、移植物功能障碍和死亡等不良临床结局强烈相关。DEFINE-HT研究表明，dd-cfDNA提供的预后信息超越了活检定义的排斥反应，能够区分具有临床干预价值的排斥反应与单纯组织学异常、识别无组织病理学证据的移植物功能障碍，并随时间进行动态风险分层。尤为重要的是，活检的低诊断阳性率与高比例低危dd-cfDNA结果共同强调了减少不必要监测性活检的潜力。这些发现表明，dd-cfDNA不仅是诊断辅助工具，更是排斥反应和移植物功能障碍的预后生物标志物，为ACES-EMB等减少活检的随机试验提供了理论依据。
