叶绿体最广为所知的生理功能是光合作用，即将太阳能转化为以糖类形式储存的化学能。英国诺丁汉大学数年来的研究揭示了叶绿体的营养组成及其多组分膜结构的物理特性，这些特性使得这一在生物圈中广泛存在的细胞器具有成为天然食品配料的资格，并可用于应对全球范围内的特定营养素缺乏问题。光合作用生物化学研究需要获得具有酶活性的纯净叶绿体制备物，这要求经过实验室规模的多阶段提取、分离和纯化过程。此类方法对制药应用可能具有商业可行性，但不适用于食品配料领域。在此背景下，研究人员开发了一种简化的工艺以回收可用于食品产品的叶绿体富集组分（CRF）。在介绍叶绿体基本特性之后，本综述：阐述了研究人员开发的提取与稳定叶绿体富集组分的方法；总结了从菠菜叶片及采后田间残留物"豌豆藤秆"（PVH）中获取的叶绿体富集组分的组成；探讨了干燥方法对CRF材料物理性质和组成的影响；确定了热处理对CRF材料品质的作用；展示了人体胃肠道（GI）中广泛存在的半乳糖脂消化过程的证据；研究了消化过程中CRF材料中营养素的释放；并简要介绍了多组分膜系统/类囊体/叶绿体膜材料（CMM）的表面活性特性。
**1. 叶绿体——非常简要的介绍**
叶绿体是膜包被的亚细胞细胞器，直径3-10 μm，存在于植物和藻类中；其功能是将太阳能转化为化学能（光合作用的光依赖反应），并利用该能量通过核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）固定二氧化碳以合成糖类（暗反应或卡尔文-本森循环，即卡尔文循环）。由于叶绿体在生物圈中的广泛分布及其众多的膜堆叠结构，它们含有全球最丰富的脂质（半乳糖脂，主要由ω-3脂肪酸α-亚麻酸组成）和蛋白质（位于水相基质区的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶，RuBisCO）。
叶绿体的超结构复杂，可描述为球形或扁圆形细胞器，内部贯穿堆叠的类囊体膜（占叶绿体脂质的80%），并由外膜和内膜包裹（占叶绿体脂质的20%）。类囊体一词源自希腊语"thylakos"（意为"囊"），由Menke首次提出。蛋白质（占干重的50-60%）和脂质（占干重的25-30%）构成了叶绿体的主要成分，它们以精巧的方式排列以高效捕获光能并合成糖分子。
近年来的冷冻电镜（cryo-EM）、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）和冷冻原子力显微镜（cryo-AFM）研究，结合植物和藻类突变体的构建，揭示了类囊体膜的超结构特征。类囊体膜形成了三维连续网络，包围着称为腔的水相区域。这些有序排列的堆叠双层膜不仅为富含跨膜蛋白的光合复合体提供锚定位点，还作为绝缘体阻止质子梯度的被动扩散。光依赖反应涉及四种不同的蛋白复合体：光系统II（PSII）、细胞色素b
6f（cyt b
6f）、光系统I（PSI）和F-ATP酶；这些复合体占据类囊体膜面积的70%。类囊体膜由以下甘油酯组成：单半乳糖二酰基甘油（MGDG）、双半乳糖二酰基甘油（DGDG）、硫代异鼠李糖甘油酯（SQDG）和磷脂酰甘油（PG），其摩尔百分比分别为50%、30%、10%和10%。
这些脂质中约90%存在于双层区域，其余为蛋白复合体的组成部分；值得注意的是，与其他类囊体甘油酯不同，MGDG单独不能形成稳定的双层（层状相），而是主要形成倒六方相（H
II）或各向同性相、立方相。除甘油酯外，类囊体膜还含有以游离非酯化形式存在的其他脂质，包括类胡萝卜素和叶绿素色素，以及维生素E（α-生育酚）和K
1（叶绿醌）。α-生育酚主要位于双层膜中，可能发挥结构稳定化和抗氧化作用，少量存在于PSII复合体中，通过猝灭单线态氧（
1O
2）保护光合装置免受氧化损伤。
类胡萝卜素、叶绿素和叶绿醌集中于PSI和PSII中，二者均由包含反应中心的中央核心复合体及周围的光捕获复合体（LHC）组成。叶绿素和β-胡萝卜素富集于PSI和PSII的反应中心，而叶黄素、紫黄质和新黄质则富集于LHC I和II中。部分类胡萝卜素（15 mol%）也存在于类囊体双层膜中，其中叶黄素可增加膜刚性，β-胡萝卜素可增加膜流动性。总叶绿素（a+b）与总类胡萝卜素的摩尔比介于3:1至6:1之间，4:1为常见比值。类胡萝卜素类型的摩尔比大致为叶黄素（45 mol%）、β-胡萝卜素（25 mol%）、紫黄质（15 mol%）、新黄质（15%）。以摩尔计，叶绿素是类囊体膜中最丰富的色素分子，但总体而言MGDG是最丰富的脂质（MGDG:叶绿素摩尔比介于2:1至3:1）。
植物可分为C
3、C
4或CAM（景天酸代谢）类型；三者的主要区别在于光合作用过程中固定二氧化碳的方式。CAM植物（如仙人掌、兰花和菠萝）夜间打开气孔储存CO
2，白天进行光合作用；白天关闭的气孔限制水分流失，因此这些植物适于荒漠等干旱环境。C
4植物（如玉米、甘蔗和高粱）利用特化途径在维管束鞘细胞中浓缩CO
2，在炎热阳光充足条件下生长良好。C
3植物占所有植物和藻类的95%，在温和气候中最为常见。尽管这三类植物都含有成分相似的叶绿体，其实际组成存在差异；例如RuBisCO可占C
3植物叶绿体蛋白的50%以上，而在C
4植物中仅占8-23%。
**2. 将叶绿体视为食品配料的理由**
长期以来，植物在质体/叶绿体中合成脂肪酸，其他脂溶性分子如类胡萝卜素、叶绿素和生育酚也在质体中合成。基于这些观察，研究人员认识到绿叶蔬菜（GLV）中大多数对人类健康有价值的营养素都位于叶绿体内。由此产生若干益处：将生物量中的大部分营养素集中于天然颗粒中；将营养素与抗营养因子分离；去除细胞壁对消化酶的阻碍作用，从而提高植物营养素的生物利用度。
**2.1 叶绿体定位营养素及其生理功能**
叶绿素a和b赋予叶绿体及绿叶蔬菜鲜艳的绿色。除作为镁的来源（ centrally bound in chlorophyll structure）外，膳食叶绿素和叶绿素衍生物已显示出抗炎和抗氧化活性。与绿叶蔬菜相关的类胡萝卜素包括：β-胡萝卜素（α-胡萝卜素也存在但浓度较低）、叶黄素及玉米黄质/紫黄质（叶黄素循环的组成部分）、新黄质。α-胡萝卜素和β-胡萝卜素是维生素A的前体，对视紫红质产生和基因调控介导的生长发育至关重要。叶黄素和玉米黄质在眼部健康中发挥关键作用，通过吸收蓝光分别保护眼睛免受低光和高光胁迫。α-生育酚（维生素E）在人体中作为主要维生素E异构体，从肝脏经血液运输至其他组织，发挥脂溶性抗氧化功能。叶绿醌（维生素K
1）在凝血因子产生中发挥重要作用。α-亚麻酸作为ω-3脂肪酸，是人体必需脂肪酸，为超长链ω-3多不饱和脂肪酸的前体，其摄入与心血管死亡率降低、婴儿视觉发育改善及类风湿性关节炎患者炎症减轻等健康益处相关。抗坏血酸（维生素C）在叶绿体中用于解毒活性氧（ROS），支持先天性和适应性免疫系统功能。铁在所有介导电子传递的光合装置中必不可少，在叶绿体中的浓度高于叶片其他细胞器。锰离子作为放氧复合体的一部分存在于PSII中，通过光驱动电子丧失将水分子裂解为氧气和质子。
**3. 含叶绿体粉末的组成与性质**
**3.1 开发从植物细胞中释放叶绿体的干粉末制备方法**
许多方法已用于分离完整叶绿体和类囊体膜，方法选择取决于研究性质。传统方法假设叶绿体具有渗透敏感性，需使用冷分离缓冲液或蔗糖溶液等渗透稳定剂防止破裂。但商业制备食品配料无需如此严格的提取纯化协议；粗制备优于纯制备以避免 costly separation steps。
研究人员测试了易于工业放大的实验室规模叶绿体提取方法。最初使用蔗糖作为渗透稳定剂的 published methods，随后确立了叶绿体的营养资质：来自菠菜、羽衣甘蓝、荨麻和草的叶绿体富集组分均含有高水平蛋白质和脂质，以及显著的α-生育酚（维生素E）、β-胡萝卜素（维生素A原）、叶黄素、铁和锰浓度。为减少水和糖的使用，研究人员假设叶绿体在自然环境中保持完整。简单的榨汁步骤将细胞器释放到细胞质基质中，液泡破裂造成一定稀释。从研究工作来看，榨汁似乎保留了叶绿体的完整性，至少可作为进一步浓缩的颗粒。
图8概述了从绿色生物量（菠菜叶片和豌豆藤秆PVH）细胞中释放和稳定叶绿体的方法。离心是浓缩叶绿体的关键步骤，汁液经离心后形成富集叶绿体的颗粒（pellet），再经冷冻干燥制成叶绿体富集组分（CRF）。汁液也可直接冷冻干燥（FD）或喷雾干燥（SD）制成"汁液"粉末。喷雾干燥未使用任何载体（如麦芽糊精），颗粒未经过进一步物理处理。冷冻干燥材料（汁液或CRF）用研钵和研杵研磨，然后筛分收集小于250 μm的颗粒（即比高等植物叶绿体平均大小5 μm大50倍）。离心的益处在于营养素在CRF中比在干燥汁液中更富集，且水溶性/可分散性抗营养因子（如植酸盐和单宁酸，若存在于植物生物量中）应保留在上清液中而不存在于CRF中。
表2总结了来自菠菜叶片或PVH的一系列叶绿体富集粉末的营养组成。值得注意的是，喷雾干燥和冷冻干燥过程均很好地保留了叶绿体营养素，但导致的粉末颗粒结构和物理性质存在差异。
**3.2 豌豆藤秆和菠菜来源叶绿体粉末的营养价值**
干燥的汁液和颗粒（CRF）含有多种营养素，包括一些通过去除水分（通常占鲜重80-90%）而浓缩的维生素。通过离心浓缩分散在汁液中的叶绿体进一步富集/浓缩营养素。表3显示了5克（约一茶匙）干燥汁液或干燥颗粒（CRF）对成人饮食的贡献占成人营养素参考摄入量（NRI）的百分比。
CRF中的营养素比干燥汁液中更浓缩，PVH来源CRF与菠菜来源CRF具有相似的营养谱和浓度。PVH来源CRF较高的铁含量可能由采集过程中土壤铁残留解释；但如果是土壤污染，预期镁也会相应增加，而实际并非如此。菠菜和PVH汁液及CRF粉末的蛋白质值范围为30-60%。如果成人蛋白质需求为每天40-60克，则5克这些粉末最多可贡献成人每日蛋白质需求的8%。叶绿体中存在核酸，对患有高尿酸血症（常见形式为"痛风"）的人群构成膳食风险，因此建议将这些粉末的摄入量限制在每天5克，该量可明显提供显著的维生素A原、叶黄素、维生素E、维生素K
1、α-亚麻酸（一种ω-3脂肪酸）、铁和锰来源。
菠菜和豌豆藤秆CRF的氨基酸（AA）组成与动物来源（白蛋白）和植物来源（大豆）的高质量蛋白质进行了比较。CRF的氨基酸含量显著低于白蛋白，但与大蛋白基准大豆的氨基酸谱相当。菠菜CRF含有略高于豌豆藤秆CRF的必需氨基酸，某些情况下甚至超过大豆。菠菜CRF特别富含支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）和谷类缺乏的赖氨酸。
基质蛋白RuBisCO是叶绿体中最丰富的蛋白质，在C
3植物中占该细胞体所有蛋白质的50%（质量比）。其富含必需氨基酸，大规模直接从绿色生物量中提取在2011年已被记录，现已成为商业现实。尚未开发的是商业过程，将叶绿体从绿色生物量中释放并直接用于应用，或进一步分离为CMM和基质部分；这将增加从绿色生物量获取的产品范围，增强回收叶绿体的经济可行性。
**3.3 新鲜菠菜汁液或菠菜叶绿体富集组分（CRF）粉末的物理性质**
除测量叶绿体富集材料/粉末的组成外，研究人员还研究了其物理性质。粒度及形态、以及在水中的溶解性被测量/观察。这些物理性质为将这些材料纳入食品/药剂配方提供了相关信息。还测量了叶绿体富集材料/粉末的水分含量和水分活度（A
w）；这些参数提供了这些材料预期货架期的指标。
体积平均直径（D
4,3）受干燥技术显著影响：喷雾干燥汁液（SJ）为9.81 μm，冷冻干燥汁液（FJ）为66.44 μm。菠菜CRF粉末（FC）的D
4,3几乎是FJ的两倍；FC和FJ均用研钵和研杵研磨后通过250 μm筛网，因此冷冻干燥汁液颗粒比CRF颗粒更小的现象表明，冷冻干燥汁液形成的固体比冷冻干燥浓缩颗粒形成的固体更脆/更易碎。
通过光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）研究了SJ、FJ、FC和新鲜颗粒/CRF的颗粒形态。光学显微镜显示所有样品中均可见单个绿色细胞器或小簇。单个叶绿体直径范围4-10 μm，与文献值一致。这些发现证实榨汁可从细胞中释放完整叶绿体，且喷雾干燥和冷冻干燥后得以保留。SEM揭示了这些材料在原始状态下的形状（不在水中再悬浮），分辨率更高：SJ粉末（无添加载体）显示不规则球形颗粒，表面有许多收缩和凹陷。鉴于这些凹陷物体的丰度和大小，它们很可能是叶绿体。表面凹陷由毛细作用力、进气温度、干燥速率、快速壁固化以及干燥早期不均匀收缩等多种因素的复杂相互作用导致。
冷冻干燥获得的叶绿体粉末（FJ和FC）具有不规则形状的颗粒，呈片状习性，这是冷冻干燥产品的典型特征。该现象由加工过程中材料内部形成冰晶所致，有助于防止细胞器结构的收缩和坍塌。除粒度和形态外，还测量了干燥菠菜叶绿体材料的一些其他物理性质。新鲜颗粒/CRF具有高的水分含量（83.9 ± 0.2 g/100 g湿质量），可能促进食品降解和微生物生长，从而降低货架期。喷雾干燥和冷冻干燥汁液的水分含量约为9%（湿质量）；冷冻干燥CRF的水分含量为4.0%（湿质量）。降低微生物生长并增强长期储存稳定性的果蔬汁粉产品推荐水分含量为5%（湿质量）。
水分活度（A
w）在0-1范围内测量，1代表纯水，所有水分子自由且未与其他分子结合。自由水是大多数生化反应发生所必需的。水分活度高于0.3预测较短的货架期，因为有更多自由水可用于酶促褐变和脂质氧化等劣变反应。新鲜CRF的水分活度为1，相当于蒸馏水；该高水分活度促进生化反应并支持细菌、酵母和霉菌的生长。冷冻干燥后CRF的水分活度显著降低至0.24 ± 0.02。SJ（喷雾干燥汁液）的水分活度略高于FJ（冷冻干燥汁液）（0.26和0.18）；该结果与Syamila及其合作者获得的菠菜汁数据一致（喷雾干燥0.23，冷冻干燥0.18）。有趣的是，FC（冷冻干燥CRF）的水分活度高于但水分含量低于FJ（冷冻干燥汁液）；这可能由于FJ中可溶性碳水化合物比例较高，结合水分子从而降低水分活度。
溶解性是粉末产品的基本物理性质/表征，用作食品配料的粉末通常必须具有良好的溶解性。在此情况下，根据Anderson等人提出的方法测量溶解性，以评估消化过程中食品材料的溶解性，排除酶的影响。汁液干燥（喷雾干燥或冷冻干燥）的溶解值范围为63.2-73.9%，显著高于叶绿体颗粒材料（冷冻干燥或新鲜），后者紧密范围为41.0-42.6%。似乎材料的组成比干燥方法更能决定%溶解性。汁液含有显著多于CRF的碳水化合物和灰分；这使得粉末比更浓缩的叶绿体制备物（新鲜和冷冻干燥）更具"溶解性"。
**4. biomass热烫对CRF产量和组成的影响**
早期工作关注于有效释放叶绿体并保留其结构和生化组成的方法。该过程产生了稳定的干燥粉末，其营养组成与新鲜叶绿体材料非常相似。这些粉末在适当条件下长期储存期间保留了营养素。然而，如果将未充分利用的绿色生物量转化为叶绿体粉末成为商业现实，供应链可能需要热稳定化步骤，无论是对原料生物量还是对来自新鲜生物量的汁液。
研究人员测试了热烫生物量对从所得CRF的产量和质量的影响。100°C热水30秒后冷却的热烫处理导致细胞内部结构发生显著变化。新鲜叶片中可见叶绿体的完整结构：细胞壁、类囊体、组装的基粒堆叠和质体小球。热烫后叶绿体精细超结构的完整性大量破坏，细胞内容物变得不可区分和无序。这种形态变化本身可能不影响来自热烫菠菜叶片粉末的组成和性质，但热烫菠菜叶片的汁液产量很低，由于热烫菠菜叶片的滑溜质地。通过将叶片在0.3 M蔗糖中混合克服了这一困难。
热烫生物量对PVH来源CRF产量和组成的影响也进行了测试。初始工作测试了萎蔫（在33%、65%和93%相对湿度下暗处一周）和发酵（在密封袋中室温暗处一周）以及热烫（蒸汽7分钟，冷却5分钟）对PVH来源CRF组成的影响。萎蔫和发酵均导致脂溶性营养素的显著损失。这一发现强调了如果目标是获得富含叶绿体定位营养素的去细胞壁材料，则需尽快加工PVH。与热烫菠菜叶片不同，热烫PVH在挤压榨汁机中不"打滑"，因此汁液产量高于菠菜叶片。PVH比栽培菠菜叶片更富含纤维；纤维为挤压螺杆提供有效材料以对抗生物量细胞破碎，释放叶绿体和其他细胞内实体。
热烫生物量在榨汁前不会导致所得CRF制备物中微量营养素浓度的显著损失；与榨汁前冷冻生物量相比，热烫生物量还允许保留CRF微量营养素。但研究人员也证明了热烫生物量会导致汁液产量降低。优化叶绿体富集粉末制备过程时的另一考虑是是否需要保留具有其伴随表面活性特性的类囊体天然形式；研究人员的工作明确表明叶片热应激改变了类囊体膜的物理性质。鉴于对汁液产量和类囊体完整性的影响，不推荐在回收叶绿体前对生物量进行热处理。如果有必要抑制内源酶以保证叶绿体产品的质量和产量，则可能对来自新鲜生物量的汁液进行巴氏杀菌更为合适。
**5. 菠菜汁液巴氏杀菌对含叶绿体干燥粉末组成和物理性质的影响**
研究人员观察到新鲜菠菜汁液中相当比例的半乳糖脂（叶绿体中的主要脂质）随时间水解，因此最好不要将新鲜菠菜汁液放置过久再进行热处理和/或CRF制备。脂质分解往往有利于脂肪酸氧化；游离多不饱和脂肪酸是脂肪氧合酶（LOX）的最有效底物，尽管这些酶也可作用于酯化脂肪酸。热烫和巴氏杀菌等热处理具有双重优势，可同时灭活植物和藻类细胞中天然存在的脂解酶和加氧酶。
新鲜菠菜叶片榨汁后分别在70°C 15秒（温和/M）或90°C 5分钟（强烈/I）下巴氏杀菌。两种热处理后汁液中过氧化物酶（POD）活性均降低超过95%。制备汁液粉末时使用冷冻干燥而非喷雾干燥，由于热处理的汁液体积较小。CRF按先前方法制备，即离心过滤后的汁液形成颗粒，然后冷冻干燥。
巴氏杀菌菠菜汁液不仅直接冷冻干燥，还经离心形成颗粒后冷冻干燥（来自巴氏杀菌汁液的菠菜叶片CRF：MC和IC，见表6）。出现温度依赖性凝聚现象，汁液中平均颗粒尺寸从新鲜汁液的4.4 μm增加到温和（M）和强烈（I）巴氏杀菌菠菜汁液的40.6和103.0 μm。约20%的绿色叶片脂质和蛋白质分别位于叶绿体外。因此可预期可溶性细胞质蛋白在加热时会发生凝聚，从而与叶绿体等细胞器一起离心后沉淀，而非保留在上清液相中。确实，凝聚现象似乎导致叶绿体外蛋白质可测量地沉淀到形成CRF的颗粒中；这从来自M和I热处理汁液的CRF中蛋白质相对增加（约16%）和总脂质相对减少（约30%）推断得出（将FC与MC和IC比较，表6）。灰分含量似乎不受热处理影响，干燥汁液和CRF样品中相对一致（分别约为19%和7.5%）。
为评估汁液巴氏杀菌对亲脂性微量营养素的影响，测量了汁液粉末和CRF中的叶绿素、叶黄素、β-胡萝卜素、α-生育酚和α-亚麻酸。以总干重计，巴氏杀菌（温和和强烈）对汁液粉末中微量营养素浓度影响不大，但叶绿素随热量增加而下降，强烈巴氏杀菌后损失高达45%。以干质量计，CRF材料中微量素浓度（与汁液粉末不同）受热量影响，随巴氏杀菌强度增加而降低。这可用外来蛋白质的增加有效稀释微量营养素浓度来解释。如果将结果相对于总脂质表示，则巴氏杀菌诱导的CRF样品微量营养素浓度下降不太明显；叶绿素浓度除外，其巴氏杀菌诱导下降更为明显。这与叶绿素色素对温度和湿度变化高度敏感的事实一致，这些条件可显著损害植物中的光合装置。
巴氏杀菌和冷冻干燥后，干燥的菠菜汁液和CRF制备物被研磨成细粉并用250 μm筛网筛分。经过这些处理步骤后，记录了粒度变化。干燥菠菜汁液的平均颗粒尺寸（D
4,3）从43.5 μm分别增加到温和和强烈巴氏杀菌后的69.5 μm和101.4 μm，干燥CRF平均颗粒尺寸分别从81.9 μm温度依赖性地增加到182.1 μm和167.5 μm。此外，两种巴氏杀菌条件下干燥汁液和CRF颗粒的跨度均减小。
冻结干燥菠菜汁液和CRF样品的形态通过SEM在250×和1000×放大倍数下检查。巴氏杀菌条件导致具有不同颗粒形态的粉末。这些研究的菠菜粉样品均通过冷冻干燥获得，因此表现出不规则破碎玻璃结构，这是冷冻干燥产品的典型特征。随着巴氏杀菌温度升高，汁液和CRF颗粒尺寸均增加。此外，与菠菜汁液粉末相比，从汁液制成颗粒产生CRF导致所有处理的颗粒更大。巴氏杀菌后观察到的颗粒尺寸增加可通过加热过程中菠菜汁液中蛋白质的聚集来解释。
所有处理（新鲜或加热）中，干燥菠菜汁液（7.7-9.3%）比CRF材料（3.8-4.7%）观察到更高的水分含量。所有样品中，本研究观察到的水分含量低于10%，水分活度约为0.3。这应促进粉末的微生物安全性和长期储存稳定性。
新鲜干燥汁液和CRF（FJ和FC）的溶解性分别为68.6%和25.3%，与表5中不同批次菠菜的等效样品（分别为73.9%和42.6%）相比有所降低。从FJ的68.6%降至温和和强烈巴氏杀菌后（MJ和IJ）的41.3-47.0%，从FC的25.3%降至温和和强烈巴氏杀菌后（MC和IC）的10.1-10.2%。如前所述，新鲜/未加热汁液粉末（无论干燥方式）比叶绿体富集材料更具溶解性。汁液中增加的碳水化合物和灰分在干燥状态下比叶绿体更易溶解。汁液粉末比叶绿体富集粉末更具溶解性的趋势在表8中得以保持。热处理汁液使所有样品的溶解性降低40%（汁液）和60%（CRF），汁液粉末比叶绿体粉末更具溶解性的趋势仍然保持。强烈热处理似乎未改变温和巴氏杀菌父本汁液后观察到的粉末溶解性降低。热处理引起的蛋白质变性/凝聚可能有助于溶解性，因为变性蛋白质（可能与CRF共沉淀）往往比天然形式的球状蛋白质溶解性差。
**6. 叶绿体/CRF材料作为多种天然生物可及营养素来源**
体外消化可用于测量蔬菜和水果中营养素的生物可及性。叶绿体中亲脂性营养素的生物可及性和后续生物利用度（吸收进入体内并递送至组织）受细胞壁阻碍，也受其与类囊体膜蛋白质基质紧密结合的影响。半乳糖脂（富含ω-3脂肪酸α-亚麻酸）是类囊体膜的主要部分，因此其消化也可能影响小肠中微量营养素释放到胶束相的速率（生物可及性）。
最初，研究人员使用体外模型探索了叶绿体中半乳糖脂的消化。这些研究中，CRF从热烫菠菜叶片生成，因为热烫使内源性半乳糖脂酶失活，实验仅揭示体外消化孵育期间添加的胃肠道酶的作用。菠菜叶片CRF中的半乳糖脂在体外被消化，主要在消化肠期被胰酶消化。该工作中发现人胰液（HPJ）含有能消化CRF半乳糖脂的酶，推测是胰脂相关蛋白2（PLRP2）和羧酸酯水解酶/胆盐刺激脂酶（CEH/BSSL），这些是胰分泌物中发现的可消化半乳糖脂的主要酶；此外，结果提示HPJ比常用于体外消化研究的商品猪胰提取物（PPE）更富含半乳糖脂酶活性。
消化后，α-亚麻酸（18:3）是从CRF半乳糖脂中释放的主要脂肪酸；这已从菠菜叶片和PVH来源的CRF中观察到。食物的物理性质常被忽视作为决定营养素释放（总释放量和释放速率）的因素；后者也影响成分在胃肠道中的释放位置。CRF的物理性质受汁液热处理影响；因此，溶解性变化可能影响营养素的生物可及性。热能破坏蛋白质-类胡萝卜素复合物并增强β-胡萝卜素和叶黄素的释放。这些类胡萝卜素与类囊体膜结合，保护复合物免受光合作用期间有害的光动力反应。通过释放这些分子，营养成分的整体生物可及性得以提高。此外，在植物油或脂肪存在下，类胡萝卜素等营养素的吸收显著改善。研究人员测量了生物量和汁液热处理以及油存在对叶绿体基质中亲脂性微量营养素在体外消化模型中释放到消化物胶束相的影响。静态消化模型未能完全分散来自新鲜生物量的CRF粉末；使用来自热处理生物量或汁液的CRF时，这一局限性较小。向孵育混合物中添加油提高了β-胡萝卜素和α-生育酚的生物可及性，并改善了来自新鲜PVH的CRF的分散。加热生物量或汁液似乎促进更紧密结合的亲脂性微量营养素（本例中为β-胡萝卜素）的释放。该研究中的生物可及性测量表明，CRF中显著量的亲脂性营养素被释放并可供体内吸收。从这项工作来看，将叶绿体从其细胞壁限制中解放出来（降低其生物封装程度）并将其浓缩成叶绿体富集组分（CRF）是制备天然、多营养素材料的绝佳方式。
α-亚麻酸相对较高的"可供吸收"值值得注意。研究人员假设其以游离脂肪酸形式存在，但小片段（直径小于0.22 μm）的类囊体膜或完整半乳糖脂从CRF材料释放到水相也是可能的。考虑游离α-亚麻酸在形成胶束中的可能直接作用以及因此协助来自同一细胞器类胡萝卜素的胶束化是很有趣的。
Sahaka M.及其合作者的近期工作揭示，可以使用红外光谱监测半乳糖脂酶PLRP2的作用。测试了CRF形式的完整叶绿体以及纯半乳糖脂混合胶束；结果显示即使在没有胆盐的情况下，PLRP2也能从叶绿体膜半乳糖脂中释放几乎所有脂肪酸。此外，两项针对全植物叶片和微藻的研究揭示，PLRP2甚至能高效水解细胞壁存在下的类囊体膜半乳糖脂。因此，像PLRP2这样大的消化酶（50 kDa）可以穿过植物细胞壁首先接触细胞质膜然后接触细胞器膜。这些发现提示酶通过细胞壁聚合物基质中的"孔"（包括胞间连丝）渗透。PLRP2还可消化植物膜磷脂得益于其磷脂酶A
1活性，该活性可能与胰磷脂酶A
2偶联。
除体外消化性研究外，研究人员还测量了斑马鱼饮食中添加菠菜CRF材料替代部分鱼粉时的营养素生物利用度。叶绿体标志脂质如α-亚麻酸、十六碳三烯酸（16:3 n- feats-3）和类胡萝卜素（如叶黄素）被摄入鱼体，叶黄素尤其集中在雌鱼卵中。鱼体内维生素A也增加，表明叶绿体β-胡萝卜素（维生素A原）被摄入鱼体并随后转化为视黄醇。该研究不仅展示了CRF材料的消化性和生物可及性，还首次间接证明了植物半乳糖脂中脂肪酸在动物物种中的有效消化和吸收。
**7. CRF和叶绿体膜材料（CMM）的表面活性特性**
**7.1 CRF在油脂消化过程中的表面活性行为**
研究人员的消化工作集中在完整叶绿体的分解和营养素释放上。已证明CRF材料中的半乳糖脂被含PLRP2和CEH/BSSL的人胰液消化。纯类囊体膜对油水界面具有高亲和力，已证明叶绿体膜可通过阻挡脂酶-辅脂酶复合物和胆盐与油水界面的结合来减缓三酰甘油（TAG）消化。这提出了一个问题：CMM（富含类囊体膜的叶绿体膜材料）是否从完整叶绿体中释放，并在胃肠道中保持完整/未消化足够长时间以保留其覆盖油滴的能力，从而可能降低三酰甘油（油和脂肪）消化速率。
为解决这个问题，在体外人类消化模型中，研究人员将CRF（富含半乳糖脂）和油（富含三酰甘油/TAG分子）作为离散材料（CRF/水/油混合物，CWO）或作为乳液（均质化CRF/水/油混合物，CWO-E）结合。将这些制备物暴露于脂解酶后，半乳糖脂和TAG水解产物作为其消化的量度。总体而言，结果表明在油存在下（CWO），CRF材料中的半乳糖脂对脂解更具抵抗力。预乳化以优化叶绿体膜在油水界面的覆盖（CWO-E）进一步保护半乳糖脂免于水解。不仅油减缓了CRF中半乳糖脂的消化，CRF的存在也降低了TAG的消化速率。与测量半乳糖脂消化时所见类似，CWO-E乳液中TAG消化慢于CRF和油作为单独实体添加时（CWO）。一种可能的解释是使用单独实体时脂酶的分配：胰脂酶优先与油滴结合，而PLRP2与叶绿体膜结合。CWO-E乳液中只有一种界面可用，其中CMM的存在可能损害胰脂酶对TAG的渗透/获取，PLRP2对半乳糖脂的活性也可能降低。
**7.2 CRF材料在油包水乳液和脂肪连续模型食品中的表面活性行为**
构成类囊体膜的多数蛋白质和脂质具有两亲性质，因此有充分理由测试叶绿体及其衍生物的表面活性特性。使用菠菜P-CRF材料（等同于已描述的CRF材料）、油和水制备了油包水（o/w）乳液。o/w液滴尺寸分布（DSD）表明，添加的CRF材料越多，乳液液滴直径越小。CRF材料可在4°C稳定o/w乳液数天。这与Rayner及其合作者以及Tenorio及其合作者的工作一致；两个研究团队使用以略微不同方式制备的类囊体膜创建了o/w乳液，这些乳液在4°C保持稳定超过七天。Tenorio及其合作者提供了强有力的证据，表明类囊体片段通过Pickering（颗粒）机制稳定油包水滴，鉴于：1. 类囊体膜的70%由四种蛋白复合体组成，每种富含不易或快速解开并将其复杂疏水核心对齐到油表面的跨膜蛋白；且2. 这些复合体之间的双层区域富含不显示促进稳定油包水乳液所需正曲率脂质单层几何形状的甘油酯。CRF制备物稳定油水界面的精确机制尚不清楚。鉴于基质球状蛋白如RuBisCO存在于CRF制备物中，连续水相中油滴的稳定性可能通过完整类囊体膜片段的Pickering（颗粒）稳定化，或通过球状蛋白在油水界面的展开，或两者随时间以不同程度实现。
研究人员还提取了菠菜叶绿体脂质并测试了该提取物影响油连续相中物质流动的能力。由于菠菜脂质含有大量MGDG和DGDG，观察到的流动增强能力可能是半乳糖脂的结果，但其他甘油酯也不应忽视；鉴于叶绿体中甘油酯的几何形状，DGDG、SQDG和PG似乎比最丰富的MGDG更可能负责这一物理效应。研究人员还探究了完整的多组分类囊体/叶绿体膜材料的表面活性特性；增强的表面活性特性将为从叶绿体中商业释放类囊体膜提供依据，除完整叶绿体的营养价值外提供更多应用。这也将允许将叶片材料作为表面活性配料使用而无需有机溶剂提取。
开发了一个模型巧克力体系（65%（w/w）糖-油悬浮液）以评估天然表面活性剂作为合成乳化剂聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR）替代品的潜力，PGPR用于降低某些配方中融化巧克力的屈服应力。使用该脂肪连续食品系统模型，研究人员证明了具有不同膜完整性程度的菠菜CMM（叶绿体膜材料）可降低屈服应力、流动点和表观粘度值。这些结果表明天然CMM可替代合成PGPR作为巧克力配方中的流动增强剂。
来自该工作的共聚焦显微图像为CRF的两亲性质提供了深入见解，其在糖和油界面排列自身。通过热力学，类囊体膜稳定糖和油界面并增强油基体系中的流动。这些表面活性特性可能因CRF/CMM的制备方式而异。通过理解维持类囊体膜堆叠的力，可开发制备解卷类囊体膜的特定方法。由于阳光中质子的生成和移动，叶绿体基质区pH约为8.0，腔区约为5.0。黑暗中，这些区域的pH趋向7.0。无论光照还是黑暗，类囊体双层表面由于酸性脂质PG和SQDG的存在以及膜蛋白复合体相关氨基酸的暴露羧基而带净负电荷；光照下负电荷程度倾向于增加。类囊体膜的层状结构因此由Mg
2+等抗衡离子的存在维持，这些抗衡离子抵消了类囊体膜因静电排斥而分离的趋势。二价阳离子螯合剂和温和加热（35-45°C）可用于去堆叠/解卷类囊体膜，从而定制其表面活性并最大化其表面覆盖。
**8. CRF与烹饪中使用的叶绿素糊的类比——美食中的潜在应用**
CRF制备让人联想到传统烹饪中叶绿素汁或糊的制备。叶绿素制备通常涉及将绿叶（菠菜、欧芹、水芹）在水中混合几分钟。获得的亮绿色液体然后通过细筛，在低温（约70°C）下持续缓慢搅拌加热，直到绿色颗粒浮到表面。形成的绿色浮沫用勺子收集并倒在冰上的纱布衬筛上。冷却沥干后，留在纱布上的绿色叶绿素糊被刮下，可用于烹饪或冷藏保存长达1周。短加热过程稳定了糊的绿色，随后可用于为酱汁、汤、调味品、糖果和糕点着色。
CRF作为人类食用营养配料的潜力已识别出潜在食品安全问题需要明确答案。例如，叶绿体含有核酸如嘌呤，与高尿酸血症发生率增加相关。与动物来源相比，植物来源食物含有显著较低的嘌呤。此外，一项关于膳食蛋白质来源与痛风发生率关联的纵向研究强调，摄入富含嘌呤的蔬菜与痛风发展无显著关联。尽管这并未直接消除与相对富含嘌呤的蔬菜菠菜来源叶绿体富集提取物相关的风险，但它突出了其在痛风发展方面不太可能成为比非乳制动物蛋白质来源更大的关切。
植物具有从环境中积累重金属的潜力，无论是通过根系还是直接通过叶片积累。这些金属如镉、锌和铅，倾向于以植物螯合肽或金属硫蛋白形式储存在液泡中。尚不清楚这些复合物是否会在离心过程中与叶绿体颗粒共沉淀，但这些螯合蛋白相对较低的分子质量（约7 kDa）表明它们可能留在上清液中：如果是这种情况，则从绿色生物量制备CRF材料将是将有毒重金属与富含营养的叶绿体分离的有效方式。
研究人员使用采后豌豆去壳田间残留物（PVH）生成叶绿体富集组分（CRF）。估计如果所有英国PVH都转化为CRF，它可为约200万成年人提供一整年的维生素A和铁（如果可生物利用）营养需求。未来可研究其他采后田间残留物。未来研究可聚焦于利用未充分利用的生物量，并解决初级生产者/农民的两个关键问题：如果这种生物量通常被犁回土壤，从田间移除一定比例的这种生物量对土壤健康有何影响？如果绿色生物量需要尽可能新鲜地加工，是否存在农场解决方案？
**9. 总结与结论**
叶绿体在生物圈中极为丰富，提供（完整或分离的）适用于多种应用的可再生配料来源。简单的物理过程可用于破碎细胞并将叶绿体与亲本绿色生物量分离。研究人员测试了加热和干燥制度对一系列叶绿体富集粉末物理和营养品质的影响，表明根据最终应用，所选过程具有一定灵活性。明显的是需要尽可能新鲜地加工生物量。
**10. 未来研究**
叶绿体在离体状态下对人类潜在益处方面被忽视了；鉴于其宏量和微量营养素组成，叶绿体也可能成为日益增长的全球水产养殖行业中鱼粉的可行替代品，如研究人员用斑马鱼进行的研究所提示。虽然该细胞器的营养资质——无论是组成还是其亲脂性营养素的生物利用度——已经确立，但研究人员尚未测量叶绿体中铁的生物利用度。植物来源的铁比动物来源的生物利用度低；植物细胞壁（在人类消化中抵抗）可能是铁摄取的屏障。随着某些人群向纯素饮食转变，从植物细胞中释放的叶绿体制备物可能提供良好的铁来源以及其他营养素。
研究人员工作中迄今为止忽视的一个方面是叶绿体制备物的风味：鉴于叶绿体的组成，其食用可能引发与食用抹茶（新鲜茶叶干粉）相似的鲜味感官反应。有限数量未经训练的消费者非正式品尝结果表明CRF制备物具有令人愉悦的咸味风味特征，因此叶绿体富集粉末可能用作食品调味料，正如这里讨论的叶绿素糊在美食中的传统用途以及某些海藻的使用方式。叶绿体制备物因此可能有助于改善老年人群的食欲，从而改善其饮食相关健康。
**11. 结语**
据估计地球总活体生物量为5500亿（千兆）吨，植物和藻类提供这一质量的80%。这一丰富的光合生物量中已有小部分为哺乳动物提供食物。草食动物比杂食动物从绿色生物量中提取更多营养价值，因此从植物细胞中解放叶绿体可能成为养活日益增长的全球人口的游戏规则改变者。此类叶绿体富集制备物可直接食用或喂养杂食性或肉食性动物（如鱼），再由人类食用。本综述阐述了研究人员在叶绿体富集提取物方面开展的工作：优化提取/回收方法；测量其营养成分和亲脂性营养素的生物可及性；确立干燥粉末的物理性质；破坏完整叶绿体以释放类囊体膜/叶绿体膜材料（CMM）；以及测量CMM的表面活性特性。为进一步研究和开发叶绿体奠定了基础，这将导致可应对联合国可持续发展目标2、3和12（零饥饿、良好健康与福祉、以及负责任消费和生产）的广泛应用。因此，这是一个非常值得进一步深入研究和投资的领域。
