PAD4介导的IGF2BP2瓜氨酸化稳定MCM mRNAs驱动肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)进展

《Journal of Advanced Research》：PAD4-mediated citrullination of IGF2BP2 stabilizes MCM mRNAs to drive intrahepatic cholangiocarcinoma progression

　　

摘要：肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4, PAD4)催化精氨酸残基脱氨基生成瓜氨酸，即瓜氨酸化(citrullination)这一翻译后修饰，可调控蛋白质的结构、功能及亚细胞定位。尽管已有证据表明PAD4与肿瘤进展相关，但其在肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)中的作用仍鲜有探讨。本研究旨在阐明PAD4调控ICC细胞增殖的作用及分子机制，并评估其临床相关性及治疗潜能。研究人员采用流体动力尾静脉注射(hydrodynamic tail vein injection, HTVI)及皮下异种移植模型评估PAD4体内功能；体外功能实验检测PAD4对ICC细胞增殖的影响；通过RNA测序(RNA-seq)及免疫共沉淀-质谱(co-immunoprecipitation/mass spectrometry, Co-IP/MS)分析筛选潜在靶标；采用GST pull-down、表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)及RNA免疫沉淀-PCR(RNA immunoprecipitation-PCR, RIP-PCR)检测分子互作；通过免疫组化(immunohistochemical analysis, IHC)评估ICC患者样本中PAD4的临床相关性。结果显示，PAD4是ICC增殖的关键促进因子，通过上调微小染色体维持(mini-chromosome maintenance, MCM)复合物的转录后水平发挥作用。机制上，PAD4的PAD催化结构域与IGF2BP2的KH1结构域相互作用，催化其第597位精氨酸(R597)发生瓜氨酸化，显著增强IGF2BP2对含N6-甲基腺苷(m6A)修饰的MCM2-7转录本的亲和力，从而稳定并提高MCM mRNA的表达。临床上，ICC患者中高表达PAD4提示不良预后，PAD4与IGF2BP2共高表达预示更差结局。体内实验中，联合抑制PAD4和IGF2BP2可协同抑制ICC生长。研究表明，肿瘤细胞内存在PAD4–IGF2BP2轴，通过瓜氨酸化依赖的方式稳定MCM转录本从而促进ICC进展，双重靶向PAD4和IGF2BP2是ICC潜在的新型治疗策略。

论文解读：PAD4介导的IGF2BP2瓜氨酸化稳定MCM mRNAs驱动肝内胆管癌进展

研究背景

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是一种高度恶性的肝脏肿瘤，预后极差且治疗手段有限。手术切除率低且复发率高，现有化疗及靶向治疗效果不佳，亟需发现新的分子机制与治疗靶点。肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4, PAD4)可通过催化蛋白质精氨酸残基转化为瓜氨酸（瓜氨酸化，citrullination）调控蛋白功能，在多种肿瘤中被报道具有促癌作用，但其在ICC中肿瘤细胞自主性的功能及机制尚不清楚。微小染色体维持(mini-chromosome maintenance, MCM)蛋白复合物(MCM2-7)是DNA复制起始必需的解旋酶，常在肿瘤中异常高表达，但其上游调控机制尤指与PAD4的关联在ICC中尚未见报道。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2, IGF2BP2)是重要的m^{66-甲基腺苷(m6A)修饰转录本并稳定之，但其活性是否受PAD4介导的翻译后修饰调控亦不明晰。基于此，研究人员开展本研究以探究PAD4在ICC中的致癌机制及PAD4–IGF2BP2–MCM轴的存在与意义。本文发表于《Journal of Advanced Research》。}

主要关键技术方法

研究人员收集130例ICC患者的组织芯片进行临床相关性分析。构建Pad4^-/-小鼠及野生型(wild type, WT) C57BL/6J小鼠，采用流体动力尾静脉注射(hydrodynamic tail vein injection, HTVI)法建立ICC原位模型；同时建立皮下异种移植瘤模型（人ICC细胞系HCCC-9810、HuCCT1接种于BALB/c nude小鼠）。功能缺失/获得实验通过慢病毒介导shRNA敲低或过表达PAD4/IGF2BP2完成。通过RNA-seq筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)并进行KEGG及基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)。采用Co-IP/MS鉴定PAD4互作蛋白，GST pull-down及表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)验证直接互作。通过m⁶A RIP-seq鉴定MCM mRNA上的m⁶A峰，RNA pull-down及RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)-qPCR验证IGF2BP2与MCM mRNA结合。放线菌素D(Actinomycin D)阻断实验检测mRNA稳定性。使用PAD4抑制剂GSK484及IGF2BP2抑制剂CWI1-2进行体内外药效评价。临床标本行免疫组化(immunohistochemical, IHC)染色并进行生存分析及相关性检验。

研究结果

PAD4 inhibition suppresses ICC progression in vivo

研究人员在Pad4^-/-与WT小鼠中用AKT/YAP质粒经HTVI诱导ICC，发现Pad4缺失显著降低肝体积、肝指数(liver/body weight ratio)及肿瘤灶数目与大小，Ki67及MCM2/MCM7表达下降。在皮下异种移植模型中，稳转shPAD4的HCCC-9810细胞成瘤能力显著减弱，Ki67降低，且不影响中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)标志citH3水平，表明PAD4以肿瘤细胞自主性方式而非通过NETs促进ICC进展。

Tumor intrinsic PAD4 promotes ICC cell proliferation and growth in vitro

体外实验中，PAD4敲低显著抑制HCCC-9810及HuCCT1细胞的MTT增殖、克隆形成及EdU掺入（S期DNA合成减少）；PAD4过表达则促进上述表型，证实肿瘤细胞内PAD4是ICC增殖的正向调控因子。

PAD4 modulates MCM complex expression and cell cycle progression

对WT与Pad4^-/-小鼠ICC组织RNA-seq显示差异基因显著富集于细胞周期与DNA复制通路，其中MCM2-7家族成员明显下调。体外验证PAD4敲低降低MCM2-7 mRNA水平，过表达上调之。流式细胞术显示PAD4敲低致G1期阻滞、S/G2-M期减少，过表达反之；免疫荧光显示PAD4敲低增加复制应激标志磷酸化RPA2(phosphorylated RPA2, p-RPA2)。回补MCM2或MCM7可挽救PAD4敲低引起的增殖抑制，证明PAD4通过上调MCM复合物促进DNA复制及ICC增殖。

PAD4 interacts with and citrullinates m⁶A reader IGF2BP2

Co-IP/MS筛选出RNA结合蛋白IGF2BP2为PAD4互作候选。内源/外源Co-IP、GST pull-down及SPR(Kd=211.4 nM)证实二者直接结合，共定位于细胞质。截断体实验显示PAD4靠C端PAD催化结构域、IGF2BP2靠KH1结构域介导互作。抗瓜氨酸化抗体检测发现PAD4过表达增加IGF2BP2瓜氨酸化，可被GSK484或ΔPAD突变体取消；KH1缺失或R597K点突变使IGF2BP2不能被PAD4瓜氨酸化，确认PAD4催化IGF2BP2第597位精氨酸(R597)瓜氨酸化，且不改变IGF2BP2蛋白丰度。

PAD4 promotes MCM complex expression by citrullination-mediated enhancement of IGF2BP2 binding to MCM mRNAs

m⁶A RIP-seq示MCM2-7 mRNA的3'UTR含m⁶A峰，RIP及RNA pull-down证实IGF2BP2结合MCM2-7 mRNA。放线菌素D实验显示IGF2BP2敲低加速MCM mRNA衰减，过表达延长其半衰期，证明IGF2BP2稳定m⁶

PAD4 drives ICC progression through its downstream effector IGF2BP2

IGF2BP2抑制剂CWI1-2可抵消PAD4过表达引起的细胞增殖增强、MCM2-7上调及S期比例升高。体内PAD4过表达成瘤被CWI1-2处理显著抑制，Ki67、MCM2、MCM7 IHC信号降低，证实IGF2BP2是PAD4促ICC进展的关键下游效应分子。

Elevated tumor PAD4 expression correlates with poor prognosis in patients with ICC

130例ICC组织芯片IHC显示PAD4高表达与患者总生存期(overall survival, OS)缩短显著相关；PAD4与IGF2BP2共高表达者预后最差。PAD4表达与MCM2、MCM7蛋白水平呈正相关。公共数据集GSE66255中PAD4及IGF2BP2分别与MCM2-7 mRNA水平正相关，印证临床相关性。

Combined inhibition of PAD4 and IGF2BP2 significantly weakens ICC progression in vivo

皮下移植瘤及HTVI原位ICC模型中，单独给予GSK484或CWI1-2仅部分抑制肿瘤生长，而二者联用显著减小瘤体积/重量、降低肝指数及Ki67/MCM2/MCM7 IHC信号，体内组织Co-IP证实联合用药降低IGF2BP2瓜氨酸化水平，且无明显体重下降或主要脏器毒性，提示双重靶向具协同抑瘤效果且安全性良好。

讨论与结论总结

既往PAD4研究多聚焦NET形成及染色质重塑，本研究揭示肿瘤细胞内在PAD4通过非NET途径促进ICC进展的新机制——PAD4催化IGF2BP2 R597瓜氨酸化（不改变其蛋白量）增强KH1结构域对m⁶A修饰MCM2-7 mRNA 3'UTR的结合亲和力，稳定MCM转录本并促进DNA复制与细胞周期进程。这是首次报道IGF2BP2受瓜氨酸化翻译后修饰调控其RNA结合活性。临床层面PAD4高表达及PAD4–IGF2BP2共高表达是ICC不良预后指标。治疗上GSK484与CWI1-2联用在体内外协同抑瘤且毒性低，为ICC提供了PAD4–IGF2BP2–MCM轴这一新治疗靶点。

结论原文翻译：总之，本研究确立肿瘤细胞内在PAD4是ICC进展的关键驱动因子，其通过使IGF2BP2发生瓜氨酸化，增强后者与MCM2-7 mRNA的结合从而维持DNA复制及细胞周期进程。药理学靶向PAD4–IGF2BP2–MCM轴可有效抑制肿瘤生长，凸显其治疗潜力。未来研究将聚焦于PAD4介导瓜氨酸化引起IGF2BP2结构变化及其与MCM转录本互作细节，并评估PAD4靶向治疗的长期疗效与安全性。