利用工程化逆转录酶变体引导水稻高效大片段同源序列替换的引物编辑(Prime Editing, PE)系统

《Journal of Advanced Research》：Efficient large-fragment isogenic sequence replacement in rice via prime editing with engineered reverse transcriptase variants

　　

摘要：在植物基因组编辑中实现高效且精确的大片段基因组同源序列替换(Isogenic Sequence Replacement, ISR)仍是一项重大挑战，限制了天然等位基因多样性在性状改良中的利用。本研究旨在开发一种优化的引物编辑(Prime Editing, PE)策略，用于水稻中高效大片段同源序列替换。研究人员系统比较了核酸酶介导PE、模板跳跃PE(Template-Jumping PE, TJ?PE)及GRAND PE策略，并工程化了一系列莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus, M?MLV)逆转录酶(Reverse Transcriptase, RT)变体，在水稻原生质体和稳定转基因株系中评估其性能。结果表明，TJ?PE在ISR效率与精确性上优于其他策略；经工程改造的M?MLV RT变体rPE14e4(T128N/D200C/V223Y/L435K)使ISR效率提升4.5倍，可实现最长达250?bp的精确替换。研究人员还发现引物结合序列(Primer Binding Site, PBS)与逆转录模板(Reverse Transcription Template, RTT)间非预期微同源性会导致靶位副产物，破坏该微同源性可提高编辑保真度。应用优化后的rPE14e4?TJ?PE系统，研究人员成功在优良水稻品种N9208中对xa10基因174?bp编码区进行了精确重写。结论：本研究建立了高效的PE介导水稻大片段ISR体系，所优化策略及工程化RT变体显著拓展了精确基因改写能力，将加速作物功能基因组学与分子育种研究。

论文解读：利用工程物编辑工程化逆转录酶变体引导水稻高效大片段同源序列替换的引物编辑系统

《Journal of Advanced Research》发表的该项研究由Sujie Zhang、Jingqi Du、Guigen Ma、Chao Yang、Bin Ren、Fang Yan、Shaofang Li、Xueping Zhou及Huanbin Zhou（中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室）完成。作物农艺性状改良依赖于对天然及人工遗传变异（从单核苷酸多态性SNP到大结构变异）的利用，但传统回交育种耗时费力且受连锁累赘限制。CRISPR/Cas介导的基因组编辑已实现靶向敲除、碱基编辑及短片段替换，而同源序列替换（Isogenic Sequence Replacement, ISR）——即将内源DNA序列精确替换为目标同源变异并保持完全一致的遗传背景——可无外源DNA导入地改写内源位点，是加速性状改良的重要方式。然而植物中高效精确特别是大片段ISR仍极具挑战，常规引物编辑（Prime Editing, PE）多用于点突变或<40?bp小片段编辑，大片段ISR效率低且机制不清。为此，研究人员系统比较不同衍生PE策略并工程化M?MLV逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT），以期建立适用于水稻的高效大片段ISR平台。

主要关键技术方法

研究人员以水稻品种Kitaake和南粳9208（Nangeng 9208, Oryza sativa L. ssp. japonica Geng）为材料。主要方法包括：①密码子优化并重构全长M?MLV RT（含RNase H结构域）及通过位点定向诱变构建系列RT变体（rPE14e1–e4、rPE20b含Tf1来源PE6c），连入pUbi启动子二元载体；②利用Plant PegDesigner和pegLIT工具设计pegRNA，组装至tRNA?HDV核酶阵列并克隆入二元载体；③水稻叶鞘原生质体PEG转化及农杆菌EHA105介导未成熟胚遗传转化，潮霉素筛选；④靶区段PCR扩增及Illumina高通量测序经由Hi?TOM平台分析编辑类型（野生型、精确替换、缺失、不精确编辑）与效率；⑤CRISPR?GE预测潜在脱靶位点并深度测序验证特异性。

研究结果

Isogenic sequence replacement in rice using nuclease- and nickase-based PE strategies（采用核酸酶与切口酶介导PE策略在水稻中进行同源序列替换）

研究人员将先前开发的核酸酶/MMEJ介导PE（NM?PE）引入额外sgRNA以切除靶区间并借助MMEJ修复实现ISR，同时测试nickase型PE（即TJ?PE原型）。原生质体及稳定转化结果表明，NM?PE多产生片段缺失副产物，而nickase型TJ?PE显著提高精确ISR效率并降低副产物；在OsMPK13位点TJ?PE稳定转化获得50%抗生素抗性苗中含精确ISR（3纯合、15杂合、2双等位），优于NM?PE（仅1株双等位）。结论：TJ?PE比核酸酶策略更适合大片段ISR。

Comparison of nickase-based PE strategies for isogenic sequence replacement in rice（切口酶介导PE策略在水稻同源序列替换中的比较）

研究人员比较TJ?PE与GRAND PE（双pegRNA通过互补cDNA flap退火 bridging缺口）在OsMPK13（79?bp ISR）、OsCDC48（100?bp ISR）、OsEPSPS（66?bp ISR）三个位点的表现。原生质体中TJ?PE精确ISR效率更高且副产物更少；稳定转化中TJ?PE在OsMPK13达16.22%（含纯合）、OsCDC48为8.82%（GRAND PE为0）、OsEPSPS为12.50%（GRAND PE为4.17%），且TJ?PE不完全ISR副产物比例（32.43%–47.92%）低于GRAND PE（47.05%–58.33%）。结论：TJ?PE在大片段ISR中效率和精确性均优于GRAND PE，后者因ISR模板与基因组高度同源引发竞争性退火而受抑。

Microhomology influences genome editing outcomes（微同源性影响基因组编辑结果）

分析OsEPSPS位点TJ?PE编辑发现主要副产物为~47?bp缺失伴部分片段替换，其侧翼为PBS与RTT间存在的6?bp微同源序列（microhomology, MH）。在RTT微同源区引入单碱基错配破坏该MH后，非预期缺失频率显著降低且精确ISR升高；扩展验证于OsMPK13和OsCDC48，延长PBS?RTT MH（5→8?nt）增加复杂缺失、降低精确编辑，破坏MH则恢复精确率。归一化多靶点数据显示减少PBS?RTT微同源性可显著降低缺失副产物、提高ISR精确性。结论：pegRNA内部PBS与RTT间微同源促使RTT与非靶链非经典杂交致异常修复，设计时应最小化此MH。

Engineered RT variants enhance large-fragment isogenic sequence replacement in rice（工程化RT变体增强水稻大片段同源序列替换）

基于M?MLV RT构建系列变体：恢复RNase H得rPE14c；引入稳定性突变T128N/D200C/V223Y得rPE14e1；再组合V223M与L435K得rPE14e2（V223M/L435K）、rPE14e3（T128N/D200C/V223M/L435K）、rPE14e4（T128N/D200C/V223Y/L435K）；另构建Tf1来源rPE20b。原生质体三靶点测试显示各工程化变体均优于亲本rPE14a，其中rPE14e4平均提升ISR效率4.5倍（最高7.4倍），精确编辑占比也最高。稳定转化中rPE14e4在OsRLCK185达45.00%精确ISR（rPE14a为25.00%、rPE14e2为32.50%），且rPE14e4与rPE14e2可在rPE14a无活性的OsRIPK1和OsRBOHB位点实现ISR。用rPE14e4测试OsCDC48位点递增长度ISR：148?bp（6.25%）、193?bp（8.93%）、250?bp（4.54%，含纯合与杂合），308?bp未检出。脱靶预测位点深度测序未见高于背景的脱靶突变。结论：rPE14e4显著提升大片段ISR效率与可编辑长度上限（至250?bp）且无显著脱靶。

Pe-mediated gene rewriting of xa10 in elite rice cultivar N9208（引物编辑介导优良水稻品种N9208中xa10基因改写）

白叶枯病（Bacterial Blight, BB）抗性基因xa10在优良品种N9208中含8个SNP致5个氨基酸改变（丧失功能）。研究人员用rPE14e4?TJ?PE设计含174?nt等基因序列（16 SNP + 2抗重切错配）的pegRNA，对xa10位点进行ORF改写。T0代80个独立株系中4株（5.00%）发生精确174?bp替换，均为杂合。结论：优化系统可在优良栽培种中实现内源基因大片段精确校正，为完全恢复抗性奠定基础。

讨论与结论翻译

讨论指出，本研究明确TJ?PE最适于水稻大片段ISR，减少PBS?RTT微同源性可提高保真度，工程化RT变体rPE14e4使ISR效率提高4.5倍并实现最长250?bp精确替换，并成功在N9208中完成xa10 ORF 174?bp改写。NM?PE因依赖植物主导的易错NHEJ易致缺失；GRAND PE受等基因高同源竞争退火抑制；TJ?PE利用模板跳跃机制减轻此影响且切口酶降低大缺失。pegRNA内部微同源促非经典RTT?NTS结合致截短3′ flap及异常修复，应予以破坏。恢复全长M?MLV RT（含RNase H）及引入V223Y/L435K等组合对长模板逆转录至关重要，rPE14e4突破常规PE <40?bp局限，是植物中首例>150?bp PE介导基因校正报道。xa10完全抗性需同步修正启动子EBE（>334?bp超出当前上限），后续可用已建立大片段插入策略引入合成EBE。本研究为作物PE介导精确基因校正提供机制见解与设计原则。

结论：研究发现模板跳跃引物编辑（TJ?PE）可实现高效大片段同源序列替换（ISR）。引物结合序列（PBS）与逆转录模板（RTT）间的微同源性调控引物编辑介导基因组编辑的精确性。值得注意的是，M?MLV逆转录酶（RT）的工程化改造获得了变体rPE14e4，使ISR效率提升4.5倍，并能实现长达250?bp的精确替换。该突破通过允许对天然基因变异进行精确重写以加速培育抗逆高产作物，推进可持续农业与粮食安全。