《Journal of Biological Chemistry》：Hydrogen-deuterium exchange points to inter-domain interactions in reverse gyrase that modulate conformational changes in positive DNA supercoiling
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反向旋转酶（reverse gyrase）是一种可在ATP依赖反应中催化DNA正超螺旋化的DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase），由解旋酶（helicase）结构域和I型拓扑异构酶（type IA topoisomerase）结构域组成。分离的
反向旋转酶（reverse gyrase）是一种可在ATP依赖反应中催化DNA正超螺旋化的DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase），由解旋酶（helicase）结构域和I型拓扑异构酶（type IA topoisomerase）结构域组成。分离的解旋酶结构域为DNA刺激的ATP酶（ATPase），分离的拓扑异构酶结构域可松弛超螺旋DNA。在反向旋转酶中，两结构域需协同作用以实现DNA正超螺旋化，推测是通过构象变化完成。本研究采用氢-氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS）探究海栖热袍菌（Thermotoga maritima）反向旋转酶在DNA和核苷酸结合时的构象变化。非水解型ATP类似物ADPNP结合未引起显著的HDX变化；DNA结合则导致解旋酶-拓扑异构酶界面区域（含R507和E701，其侧链参与静电相互作用）氘摄取增加（即溶剂可及性升高）。去除该电荷的R507A/E701A双突变体使超螺旋活性中度升高，提示此相互作用具轻微抑制作用。而引入半胱氨酸并氧化形成二硫键固定的R507C/E701C双突变体则完全失活。综上，解旋酶与拓扑异构酶结构域界面的重排对反向旋转酶两域功能协作及酶活性至关重要，本研究提供了反向旋转酶/DNA复合物（rgyr/DNA complex）的首个结构模型。
《反向旋转酶解旋酶–拓扑异构酶域间界面柔性及其在正DNA超螺旋中构象变化的HDX-MS研究》解读
本研究由Vaibhav P. Mhaindarkar、Frederic Collin、Philipp Koldewey及Dagmar Klostermeier（University of Muenster, Institute for Physical Chemistry）完成，论文发表于Journal of Biological Chemistry。
一、研究背景与立项依据
反向旋转酶（reverse gyrase, Rgyr）是仅存在于古菌（Archaea）和嗜热细菌（hyperthermophilic bacteria）中的特殊I型拓扑异构酶IA（type IA topoisomerase），可依赖ATP将正超螺旋（positive supercoils）引入DNA，被认为参与高温下DNA的稳定性保护。Rgyr为由N端解旋酶模块（helicase module，含H1和H2球状结构域，属超家族2解旋酶SF2）与C端拓扑异构酶模块（topoisomerase module，含T1–T4结构域呈环状排列，含催化酪氨酸Y851）共价融合而成的单体蛋白，两者间通过H2上的latch（闩锁）结构相连。已有晶体结构揭示两域间存在静电相互作用（如E507–R701），但两模块如何经构象变化实现功能偶联（functional cooperation）以完成ATP驱动的正超螺旋反应仍不清楚——这是本研究拟解决的核心科学问题。研究人员采用氢–氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange coupled to mass spectrometry, HDX-MS）探测海栖热袍菌（Thermotoga maritima）Rgyr在游离态及结合ADPNP和/或带泡DNA（DNA bubble）时的构象动态，并通过定点突变与交联实验验证域间界面柔性的功能意义，最终借助AlphaFold 3（AF3）建模给出rgyr/DNA复合物的结构模型。
二、主要关键技术方法
研究人员以重组表达纯化的海栖热袍菌野生型反向旋转酶（rgyr wt）、切割缺陷型Y851F突变体及R507A/E701A、R507C/E701C点突变体为样本。核心方法包括：（1）氢–氘交换质谱（HDX-MS），以含泡单链/双链DNA（30 nt泡区两端各10 bp GC富集双链）及/或ADPNP处理蛋白后于不同时间点淬灭、胃蛋白酶（pepsin）酶切、LC-MS/MS检测氘摄取量，肽段覆盖率>90%；（2）位点定向突变（site-directed mutagenesis）及零长度交联剂Cu(II)(1,10-phenanthroline)3（Cu-Phen3）诱导分子内二硫键形成，还原/非还原SDS-PAGE、质量光度法（mass photometry）及ESI-QTof质谱鉴定寡聚态与交联效果；（3）正DNA超螺旋活性检测——以负超螺旋pUC18为底物，75℃ ATP存在下反应，二维琼脂糖凝胶电泳（2D-AGE，第二维加氯喹chloroquine）解析拓扑异构体分布；（4）AlphaFold 3预测rgyr及rgyr/DNA/ATP复合物三维结构模型辅助HDX数据诠释。
三、研究结果
DNA- and nucleotide-induced conformational changes in reverse gyrase（反向旋转酶中DNA与核苷酸诱导的构象变化）
通过对比apo态、ADPNP结合态、DNA结合态及双配基结合态Rgyr的HDX图谱发现：ADPNP结合仅引起极小HDX变化（±10%内），Walker A/B基序区无显著变化，提示核苷酸结合本身不引发明显构象重排（type?0行为）。DNA结合则引起T4结构域单链DNA（ssDNA）结合沟槽两端（aa 725–757、1011–1030及T1下端aa 546–553）HDX显著降低（保护效应），与DNA结合位点相符；H1区亦有轻度保护。最突出的是解旋酶H2的E507所在区与拓扑异构酶T1的R701所在区（H2–T1/ T3界面）HDX显著增加，表明DNA结合诱导该界面局部解离/伸展，Cα–Cα间距由7.2 ?增至15.1 ?（AF3模型）。此变化在切割缺陷Y851F突变体中相同，说明不依赖DNA切割及DNA?gate开闭。Latch区域未见HDX保护，可能与瞬时相互作用有关。ADPNP与DNA结合顺序互换不影响上述DNA诱导HDX模式，提示两配基结合无显著协同性。
Role of E507 and R701 for reverse gyrase activity（E507与R701残基对反向旋转酶活性的作用）
为验证界面静电相互作用功能，构建R507A/E701A（电荷移除）及R507C/E701C（可形成分子内二硫键）突变体。R507C/E701C在氧化或非还原条件下出现表观~180 kDa SDS-PAGE条带，经质量光度法与LC?MS确认为单体且形成C507–C701分子内二硫键固定界面。超螺旋活性测定显示：wt与R507A/E701A均有正超螺旋活性，后者产物拓扑异构体分布更窄且偏向更高正超螺旋数，提示轻微去抑制效应、活性中度增强；R507C/E701C（交联态）几无活性（还原条件下恢复至wt水平，排除半胱氨酸本身影响）。结果表明：E507–R701间静电相互作用轻微限制域间运动，而界面柔性（interface flexibility）——即允许DNA诱导的H2相对T1/T3位移——是解旋酶与拓扑异构酶模块功能偶联及正超螺旋反应的必要条件，刚性固定该界面则完全丧失活性。
四、讨论与结论翻译
总体而言，研究人员证明正向超螺旋DNA过程中解旋酶与拓扑异构酶模块的功能协作需要在解旋酶–拓扑异构酶界面处具有充分的柔性以允许大规模构象变化，固定该界面会导致活性丧失。HDX数据指向反向旋转酶与含内部泡DNA底物的保守结合模式，并为rgyr/DNA复合物提供了共同的结构模型。结构模型提示解旋酶模块可能仅作为核苷酸依赖的双链DNA结合模块发挥作用：其DNA诱导的构象变化（H1–H2 cleft关闭）牵拉latch脱离拓扑异构酶域，为拓扑异构酶域处理单链DNA区域提供空间。
Conclusions（结论原文浓缩翻译）
总体而言，本研究表明反向旋转酶在正DNA超螺旋中解旋酶与拓扑异构酶结构域的功能协作需要解旋酶–拓扑异构酶界面具有充分柔性以实现大规模构象变化，固定该界面与活性丧失相关。HDX数据表明反向旋转酶与含内部泡的DNA底物存在保守结合模式，并为rgyr/DNA复合物提供了首个结构模型。结构模型提示解旋酶模块可能仅作为核苷酸依赖的双链DNA结合模块，其DNA诱导构象变化将latch从拓扑异构酶域拉开，为正链DNA区域被拓扑异构酶域加工提供空间。
