亮氨酰-tRNA合成酶(Leucyl-tRNA Synthetase, LeuRS)作为异丁醇介导酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生长抑制的分子靶点

《Journal of Biological Chemistry》：Leucyl-tRNA Synthetase as a Molecular Target of Isobutanol-Mediated Growth Inhibition in Saccharomyces cerevisiae

　　

研究人员对化石燃料依赖及环境退化问题迫切需要可持续能源解决方案，不依赖化石资源的生物燃料引起了广泛关注。其中，酵母发酵生产的异丁醇因其高能量密度和与现有燃料基础设施兼容，是一种有前景的下一代生物燃料，但酵母本身对异丁醇的耐受性低限制了其生产规模。本研究提供了确切证据表明，培养基中添加过量支链氨基酸(branched-chain amino acids, BCAAs)，特别是亮氨酸(leucine, Leu)，可缓解异丁醇引起的酵母生长抑制。研究人员利用饱和转移差核磁共振(saturation transfer difference nuclear magnetic resonance, STD-NMR)光谱及结构建模分析发现，异丁醇可直接与胞质亮氨酰-tRNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase, LeuRS；基因CDC60编码的Cdc60p)相互作用，并作为亮氨酸结合的竞争性抑制剂(competitive inhibitor)。综上，这些发现揭示了异丁醇抑制酵母生长的机理基础，为提高酵母异丁醇耐受性及增加异丁醇生物合成提供了新思路。

《Leucyl-tRNA Synthetase as a Molecular Target of Isobutanol-Mediated Growth Inhibition in Saccharomyces cerevisiae》论文解读

该研究背景源于化石燃料枯竭与环境压力促使可再生生物燃料开发成为热点，异丁醇(isobutanol)因具高能量密度、低吸湿性、低腐蚀性及可与汽油基础设施兼容，被视为下一代生物燃料及重要化工平台分子，可由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)经工程改造发酵生产。然而野生型酵母对异丁醇固有耐受性差，≥1.4%(v/v, ~190 mM)异丁anol即造成>50%生长抑制，严重制约发酵产量，此前异丁醇在酵母中的特异性蛋白作用靶点尚未被鉴定，其抑制生长的分子机制不明，阻碍了耐受性菌株的理性改造。本研究旨在明确异丁醇抑制酵母生长的分子靶点及作用机制，为提升酵母异丁醇耐受性提供理论依据。研究人员通过表型筛选发现支链氨基酸(branched-chain amino acids, BCAAs)尤其是亮氨酸可缓解异丁醇毒性，进而锁定亮氨酰-tRNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase, LeuRS)为候选靶点，采用饱和转移差核磁共振(saturation transfer difference nuclear magnetic resonance, STD-NMR)、分子对接(docking)及结构建模等手段证实异丁醇与胞质LeuRS(Cdc60p)直接结合并竞争性抑制亮氨酸结合，从而抑制Leu-tRNA合成及下游信号传导致生长停滞。该论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。

主要关键技术方法：

以酿酒酵母BY4741菌株为模式生物，进行异丁醇耐受性平板培养表型测定（添加单一或混合氨基酸）；从酵母基因组PCR扩增胞质LeuRS基因CDC60及线粒体LeuRS基因NAM2，构建pET-32b原核表达载体，于大肠杆菌Rosetta中诱导表达N端Trx-His融合蛋白并经Ni亲和、离子交换及分子筛层析纯化；采用700 MHz STD-NMR检测配体（亮氨酸、异obutanol等）与Cdc60p/Nam2p的结合及竞争关系；利用AlphaFold构建Cdc60p与Nam2p三维结构模型，经UCSF Chimera能量最小化后使用AutoDock Vina将亮氨酸及异丁醇对接至催化氨基酰化口袋(aminoacylation site)，分析氢键与疏水相互作用。

Effect of excess amino acids in culture medium on yeast isobutanol tolerance

研究人员在SC合成培养基中添加过量各类型氨基酸进行异丁醇(1.5% v/v)耐受实验，发现仅添加过量支链氨基酸(BCAAs: Leu、Val、Ile)能显著缓解异丁醇引起的生长抑制，且对直链1-丁醇毒性无影响；单独添加时以过量L-亮氨酸缓解效果最强，L-缬氨酸次之，L-异亮氨酸无作用，酪氨酸及其他非BCAA氨基酸亦无缓解作用。表明异丁醇毒性与BCAA特别是亮氨酸的识别机制相关。

Ligand binding analysis of LeuRS using STD-NMR

研究人员对纯化的胞质LeuRS(Cdc60p, 基因CDC60产物)和线粒体LeuRS(Nam2p, 基因NAM2产物)进行STD-NMR分析。亮氨酸与Cdc60p和Nam2p均产生明显STD信号（Cdc60p甲基质子Peak 1相对强度57.4%，Nam2p为9.7%），证实二者均可结合亮氨酸且Cdc60p亲和力更高。异丁醇仅与Cdc60p产生显著STD信号（甲基质子Peak 1相对强度24.8%），与Nam2p几乎无作用（<2%）。Cdc60p也可弱结合1-丁醇但不结合乙醇、Val或Ile。等摩尔亮氨酸与异丁醇混合体系中两者STD信号均下降（亮氨酸由57.4%降至23.2%，异丁醇由24.8%降至3.5%），证明二者竞争Cdc60p上重叠结合区域且亮氨酸亲和力高于异丁醇。

Structure modeling of LeuRS

研究人员用AlphaFold建模并结合AutoDock Vina对接显示，亮氨酸和异丁醇均优先结合于Cdc60p催化结构域的氨基酰化口袋(aminoacylation pocket)而非CP1编辑位点(editing site, CP1 domain)，异丁醇可容纳于同一口袋，其羟基与Trp215吲哚氮及Thr207羟基形成氢键，预测结合自由能ΔG = -3.6 kcal/mol；亮氨酸则与Phe33酰胺NH及Ala28羰基形成氢键，预测ΔG = -5.2 kcal/mol，且结合口袋表面积(134.7 ?²)大于Nam2p(85.4 ?²)。Nam2p虽可结合亮氨酸(ΔG = -3.4 kcal/mol)但其口袋较小且未预测到异丁醇在催化位点的有利结合，与STD-NMR结果一致。差异源于结合口袋三维构象及大小影响配体特异性。

讨论与结论翻译：

本研究表明，培养基中添加过量支链氨基酸特别是亮氨酸可缓解异丁醇诱导的酿酒酵母生长抑制，且异丁醇作为亮氨酸的竞争性抑制剂作用于胞质亮氨酰-tRNA合成酶(Cdc60p)。异丁醇可被动扩散进入细胞达到~108 mM高浓度，远超过Cdc60p(~0.4–1 μM)及胞内亮氨酸(1–2 mM)，故能有效竞争结合Cdc60p并抑制其氨酰化功能，减少Leu-tRNA^Leu合成。Leu-tRNA^Leu减少导致未负载tRNA积累激活GCN2/eIF2α磷酸化的一般氨基酸控制(general amino acid control, GAAC)通路抑制翻译起始，同时削弱Gtr1介导的TORC1(target of rapamycin complex 1)活化致蛋白合成与细胞生长受抑。胞质LeuRS(Cdc60p)是异丁醇毒性的关键分子靶标，线粒体型Nam2p不参与此过程。该发现阐明异丁醇抑制酵母生长的分子机理，为理性改造酵母提高异丁醇耐受性及产量提供了新靶点。