《Journal of Biological Chemistry》：Substrate recognition and cleavage by mucin degrading O-glycopeptidases from the gut microbe Bacteroides caccae
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O-糖肽内切酶是通过一种涉及对底物上 O-连接聚糖进行特异性识别的机制，来水解糖蛋白中肽键的酶。Bacteroides caccae 是一种高效的黏蛋白降解菌，属于人类肠道微生物群，其基因组中含有 16 个编码肽酶_M60（peptidase_M60）家族推定
O-糖肽内切酶是通过一种涉及对底物上 O-连接聚糖进行特异性识别的机制，来水解糖蛋白中肽键的酶。Bacteroides caccae 是一种高效的黏蛋白降解菌，属于人类肠道微生物群，其基因组中含有 16 个编码肽酶_M60（peptidase_M60）家族推定 O-糖肽内切酶的基因。目前，O-糖肽内切酶底物选择性的多样性尚未得到充分理解，而在 B. caccae 这类细菌中此类酶基因扩增的原因也尚不清楚。本研究揭示了 B. caccae 基因组编码的肽酶_M60 O-糖肽内切酶的活性与多样性。16 个肽酶_M60 基因中至少有 13 个编码具有活性的黏蛋白水解酶。通过高通量 FRET（荧光共振能量转移）筛选结合详细动力学分析的靶向功能研究发现，来自一个此前未表征的肽酶_M60 蛋白分支的 5 个代表性酶，均为特异性的 O-糖肽内切酶，尽管彼此亲缘关系较近，但其底物选择性各不相同。对这些酶开展的结构分析，包括结合复合物的解析，揭示了 O-糖肽内切酶多样性分子基础的新认识。这一结果进一步强调了肽酶_M60 O-糖肽内切酶在针对底物聚糖部分和/或肽段部分时，其选择性可呈现出高度多样化，并解释了为何 B. caccae 这类黏蛋白降解菌会扩展 O-糖肽内切酶的底物谱，以潜在地最大化对这种异常复杂聚合物的降解。
该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》，聚焦人肠道共生菌 Bacteroides caccae 中 peptidase_M60 家族 O-糖肽内切酶的功能扩张及其底物识别机制。研究背景在于，宿主黏液层是机体抵御微生物入侵的第一道屏障，其核心成分黏蛋白（mucin）含有大量 O-连接聚糖，既赋予其高度水化和黏弹性，也保护肽主链免受一般蛋白酶切割。对肠道定植菌而言，能够降解黏蛋白意味着获得独特生态位与营养来源，尤其在膳食纤维匮乏时，黏蛋白利用能力可能显著增强菌体适应性。然而，尽管 peptidase_M60 家族已被确定为一类依赖 Zn
2+ 的 O-糖肽内切酶，其如何在不同聚糖结构、不同肽序列背景下实现精细选择，仍缺乏系统认识。尤其是 B. caccae 基因组编码多达 16 个推定 peptidase_M60 基因，这种异常扩张现象的功能意义此前并不明确，因此有必要从活性谱、底物偏好与结构基础三个层面展开研究。
研究人员首先对 B. caccae 的 peptidase_M60 金属肽酶结构域进行了系统序列比较和系统发育分析，发现这些酶分布于多个分支，序列差异显著，提示其可能具有功能分化。随后，研究人员重组表达并纯化了其中 12 个金属肽酶结构域截短体，利用基于牛颌下腺黏蛋白的微孔板黏蛋白酶实验评估活性。结果显示，这 12 个重组蛋白均具有不同程度的黏蛋白降解能力，且均受 EDTA 抑制，证明其符合金属依赖性黏蛋白酶特征。结合文中结论，至少 13 个 peptidase_M60 基因编码有活性的黏蛋白降解酶，说明该菌确实部署了庞大的 O-糖肽内切酶体系以适应黏液环境。
为解析这些酶是否具有不同底物谱，研究人员重点选择 clade 1 中 5 个代表酶 BcM60B、BcM60C、BcM60F、BcM60K 和 BcM60M 进行深入研究。研究构建了一个高通量 FRET 底物筛选平台，底物由 mNeonGreen 和 mScarlet-I 两种荧光蛋白夹持一段富含 PTS 特征的黏蛋白样连接肽构成，并引入多种 O-聚糖修饰，包括 Tn 抗原、core 1（C1）、2,3-唾液酸化 core 1（3SC1）、2,6-唾液酸化 core 1（6SC1）与 core 2（C2）。该体系实现了对聚糖结构和肽序列双变量的并行评估。以经典 O-糖肽内切酶 BT4244 为参照，筛选结果与既往认识一致，验证了平台的可靠性。进一步分析表明，BcM60C、BcM60K 和 BcM60M 的底物指纹相近，但与 BT4244 不同，它们能够识别含分支聚糖的 C2 底物，并且对 6SC1 也具有一定容忍性；BcM60F 活性较低，仅识别有限底物；BcM60B 虽在黏蛋白实验中有弱活性，却在 FRET 面板中无可检测切割，提示其可能依赖本文筛选体系未覆盖的特殊糖链或肽环境。
研究人员进一步采用动力学分析对活性差异进行定量描述。结果显示，这些酶总体上具有较低的 kcat 和较高的表观亲和力，但不同酶对聚糖的偏好存在显著差异。BcM60K 的偏好顺序为 C1 > Tn ≈ C2 > 3SC1 ≈ 6SC1，说明末端 α-2,3-连接唾液酸会明显降低切割效率；利用 α-2,3-唾液酸苷酶 NanH 预处理 3SC1 底物后，BcM60K 活性提高 3–5 倍，进一步证明该唾液酸修饰具有不利影响。BcM60M 的偏好则为 C1 > C2 > Tn > 3SC1 > 6SC1，对 C2 与 6SC1 的区分更加明显；BcM60C 的整体效率低于 BcM60K，但也更偏好 C1；BcM60F 对 Tn、C1 和 3SC1 区分不明显，却整体反应缓慢。这些结果表明，即便同属未表征近缘分支，酶之间仍形成了不同的聚糖选择模式。
除糖链外，本文进一步证明肽序列背景也是决定切割效率的重要因素。研究人员观察到，即使携带相同 O-聚糖，MUC5AC_R2 底物通常优于 IgA1 hinge 底物，因此通过“好底物/差底物”杂合连接肽设计，交换糖基化位点两侧序列，检验肽段局部环境的贡献。结果显示，将优良底物 MUC5AC_R2 的 N 端或 C 端片段置换入差底物均可提高 BcM60K 的切割，其中 N 端替换效应最显著，提示切割位点 P 侧残基对识别尤为关键。该结果说明 peptidase_M60 并非仅由糖链决定特异性，其对底物肽主链的识别同样精细，并且不同序列组合会深刻影响酶效率。
方法概括：研究人员主要采用系统发育与序列比较分析、重组蛋白表达纯化、基于牛颌下腺黏蛋白的黏蛋白酶活性检测、高通量 FRET 底物文库筛选、反应进程曲线与全局拟合动力学分析、NanH 协同酶学实验、RP-HPLC-MS 糖基化状态分析，以及 X 射线晶体学与配体复合物结构解析等技术方法，系统研究 B. caccae 的 peptidase_M60 O-糖肽内切酶活性、多样性及其底物识别分子基础。本文未涉及人体临床样本队列研究。
在“Bacteroides caccae O-glycopeptidases”部分，研究人员通过序列身份矩阵和大规模系统发育分析发现，B. caccae 的 peptidase_M60 酶分属 4 个主要分支，提示显著功能异质性。随后对 12 个重组酶的实验验证表明，它们均具有 EDTA 敏感的黏蛋白降解活性，从而确立了该菌广泛部署功能性 O-糖肽内切酶的事实。
在“Substrate screening”部分，研究人员建立包含 47 种不同连接肽/聚糖组合的 FRET 筛选体系。该部分结果显示，BT4244 偏好 Tn、C1 和 3SC1，而不耐受 C2；相比之下，BcM60C、BcM60K 与 BcM60M 可切割 C2，并对某些 6SC1 底物也表现活性，提示其能够容纳分支 O-聚糖。BcM60F 底物谱窄，BcM60B 则未在该体系中显示活性。
在“Quantitative analysis of glycan selectivity”部分，研究人员通过详细动力学实验量化酶对不同糖链的偏好，明确了末端唾液酸、分支结构以及不同核心糖型对催化效率的影响。结果说明，多数酶偏好 C1，但对三糖型聚糖的容忍度不同；其中 BcM60K 受 3SC1 抑制较明显，BcM60M 对 C2 相对更偏好，显示近缘酶之间存在可分辨的功能分化。
在“Assessment of peptide composition on BcM60K activity”部分，杂合连接肽实验表明，底物肽主链不是被动骨架，而是底物识别的重要组成部分。P 侧序列置换尤其能够显著提升差底物的切割效率，说明切割位点 N 端邻近氨基酸与酶活性位点之间存在关键配对作用。
在“Structural analysis”部分，研究人员解析了 BcM60B、BcM60F、BcM60K 和 BcM60C 的游离结构，以及 BcM60C/BcM60K 与 C2-Thr、6SC1-Ser 的复合物结构，还解析了失活突变体 BcM60K E664A 与 MUC5AC 来源 O-糖肽的复合物结构。结构结果揭示，不同酶在 G2’’ 亚位点的形状、电荷和开放程度方面存在显著差异，这是决定其能否容纳分支聚糖的关键。BcM60C 与 BcM60K 具有可容纳 C2 和 6SC1 的 G2’’ 口袋；BcM60F 虽有缩短的催化螺旋，但口袋被局部侧链“夹窄”；BcM60B 的 G2’’ 位点则被堵塞，反而形成邻近 G1’ 的带正电小口袋。MUC5AC 糖肽复合物进一步显示，底物 P2 到 P3’ 残基与酶活性沟形成反平行 β-链样配对，GalNAc 位于 G1’ 亚位点，结构上支持该类金属肽酶的催化模型，也为“P 侧序列更重要”的功能观察提供了直接依据。
在讨论部分，研究人员认为，B. caccae 的 clade 1 O-糖肽内切酶至少代表 3 类不同选择性：一类可同时容纳线性与分支聚糖，另一类主要偏好线性聚糖，还有一类可能识别尚未定义的特殊修饰底物。关于糖链识别，G3’ 区域电荷性质可能影响对 3SC1 中 Neu5Ac 的容忍度；关于分支糖链识别，缩短的催化螺旋有利于形成 G2’’ 口袋，但仍需结合局部侧链构型共同决定底物接纳能力。BcM60M 中 Tyr620 与 BcM60K 中对应 Phe 残基的差异，部分影响 C2 与 6SC1 的区分，但并不能完全解释两酶差异，说明底物选择由多重结构因素协同决定。对于 BcM60B，研究人员根据结构建模提出其可能偏好 6-sulfo-GalNAc 修饰的线性 O-聚糖，但这仅作为文中提出的结构解释与功能假说，尚未被直接实验验证。
综合全文，研究结论可概括为：B. caccae 基因组中扩张的 peptidase_M60 O-糖肽内切酶并非冗余重复，而是形成了具有不同聚糖偏好和肽序列偏好的功能库。糖链结构与肽段特征的组合共同塑造底物特异性，哪怕亲缘关系很近的酶也可表现出清晰可分的底物选择差异。这种多酶协同的底物谱扩展机制，能够帮助 B. caccae 更高效地降解高度复杂的黏蛋白聚合物，从而增强其在肠道黏液生态位中的适应与竞争能力，也提示 O-糖肽内切酶基因扩张可能是高效黏蛋白降解菌的重要分子标志。
