ErbB受体差异性二聚化调控表皮生长因子受体配体对代谢通量的影响

《Journal of Biological Chemistry》：Differential ErbB receptor dimerization modulates the ability of EGF receptor ligands to regulate metabolic flux

　　

表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶可结合七种不同的激动剂配体。表皮生长因子（EGF）可刺激MCF-7细胞增殖，而epigen（EPG）和epiregulin（EPR）则刺激分化。这种差异被认为是由配体偏向性（ligand bias）现象所致，即两种激动剂结合同一受体却产生不同的反应。已报道的表皮生长因子受体配体间的这些差异促使研究人员检测了这些配体连同神经调节蛋白2β（NRG-2β，一种ErbB3-ErbB4配体）对MCF-7细胞和MDA-MB-468细胞代谢的影响。研究人员采用¹³C示踪代谢通量分析，追踪[1,2-¹³C]-葡萄糖或[U-¹³C]-谷氨酰胺的碳原子在早期中间代谢途径中的流向。EGF刺激两种细胞系中糖酵解、磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸循环（TCA cycle）的通量。然而，MCF-7细胞将PPP中的核糖导向核苷酸生物合成，而MDA-MB-468细胞则通过PPP的非氧化途径将核糖回收至糖酵解。在MDA-MB-468细胞中，所有表皮生长因子受体配体诱导相似的代谢通量水平，而NRG-2β无活性。相反，在MCF-7细胞中，NRG-2β、btc（betacellulin）、EPR和EPG刺激代谢通量的效果显著优于其他表皮生长因子受体配体。因此，偏向性在MCF-7细胞中明显，而在MDA-MB-468细胞中不存在。由于两种细胞系表达不同组合的ErbB家族受体，研究人员推测反应差异是不同配体优先诱导特定同源二聚体或异源二聚体配对的结果。该研究结果强调了在解释与配体偏向性相关的数据时，需考虑细胞中系统偏向性存在的可能性。

表皮生长因子受体作为经典的受体酪氨酸激酶，由胞外配体结合域和胞内酪氨酸激酶域构成。激动剂配体与受体结合后诱导受体形成二聚体，进而激活激酶域并引发受体自磷酸化，最终产生下游信号转导效应。表皮生长因子受体所属的ErbB家族还包括ErbB2、ErbB3和ErbB4三种同源受体。其中ErbB2无已知配体，ErbB3虽有配体结合能力但缺乏内在酪氨酸激酶活性，因此这两种受体的信号转导均需依赖与其他ErbB家族成员形成异源二聚体。表皮生长因子受体可结合七种不同配体，包括高亲和力配体EGF、转化生长因子α（TGFα）、肝素结合表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）和BTC，以及低亲和力配体双向调节蛋白（AREG）、EPG和EPR。尽管这些配体均结合于表皮生长因子受体的同一位点，却能诱导同一细胞产生不同的生物学反应，这一现象被称为"配体偏向性"。生长因子促进细胞增殖或分化的核心能力在于其调控产生能量和生物量的代谢途径，但关于表皮生长因子受体配体如何调控中间代谢的了解甚少。本研究发表于《Journal of Biological Chemistry》，研究人员采用代谢通量实验方法，以两种广泛用于研究的乳腺癌细胞系——雌激素受体阳性的MCF-7细胞和三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞为模型，系统比较了七种表皮生长因子受体激动剂配体及ErbB3-ErbB4配体NRG-2β对葡萄糖代谢的影响，旨在探究激动剂特异性生物学效应的差异是否 preceded by 代谢调控能力的差异。

研究人员开展的关键技术手段包括：样本来源于美国典型培养物保藏中心（ATCC）的MCF-7细胞和MDA-MB-468细胞；采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS，使用Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC系统耦联Orbitrap ID-X质谱仪，HILICON iHILIC-(P) Classic HILIC色谱柱）进行代谢组学分析；利用RNA测序（RNA-Seq，由Plasmidsaurus公司进行3'端计数）检测ErbB受体表达水平；运用蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测受体磷酸化及Akt、MAP激酶（MAPK）活化状态；采用稳定同位素示踪技术，使用[1,2-¹³C]-葡萄糖和[U-¹³C]-谷氨酰胺作为示踪剂，结合X13CMS、Compound Discoverer、Skyline和AccuCor等软件包进行同位素富集数据分析。

**ErbB受体在乳腺癌细胞系中的表达**

研究人员首先通过蛋白质免疫印迹和RNA-Seq检测了两种细胞系中四种ErbB家族受体的表达水平。结果显示，MDA-MB-468细胞中表皮生长因子受体表达极高（约10⁶个受体/细胞），而MCF-7细胞仅约20,000个/细胞；MCF-7细胞表达ErbB3和ErbB4，而MDA-MB-468细胞ErbB4缺失且ErbB2、ErbB3表达较低。该部分结果强调了在判断ErbB受体表达时需谨慎对待蛋白质免疫印迹结果，建议结合RNA-Seq数据以提高准确性。

**EGF对MCF-7细胞代谢的影响**

研究人员以5 mM [1,2-¹³C]-葡萄糖为示踪剂，追踪碳流在糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环中的流向。结果表明，4小时孵育条件下，EGF modestly 但显著刺激糖酵解中间产物的通量，同时增加乳酸池，证实EGF增强MCF-7细胞糖酵解通量。在磷酸戊糖途径方面，EGF刺激该途径中间产物的通量，但未显著增加核糖-5磷酸（ribose-5P）的通量，且m＋1核糖-5磷酸为主要同位素异构体，提示非氧化途径使用有限。然而，EGF强烈刺激m＋1同位素异构体的四种核糖核苷酸通量，表明m＋1核糖-5磷酸被导向核苷酸生物合成。此外，[U-¹³C]-谷氨酰胺标记实验显示EGF促进UTP和CTP嘧啶骨架的标记，证实细胞活跃进行从头核苷酸合成。三羧酸循环方面，EGF促进¹³C标记物从葡萄糖进入几乎所有三羧酸循环中间产物，同时促进[U-¹³C]-谷氨酰胺进入三羧酸循环中间产物，提示葡萄糖和谷氨酰胺来源的碳对三羧酸循环的贡献相对平衡。

**其他表皮生长因子受体配体对MCF-7细胞代谢的影响**

研究人员检测了七种表皮生长因子受体配体（EGF、TGFα、HB-EGF、BTC、AREG、EPG、EPR）及NRG-2β对MCF-7细胞的影响。信号转导层面，NRG-2β、EGF和BTC诱导最高水平的表皮生长因子受体磷酸化，而TGFα、HB-EGF、EPG和EPR约为一半，AREG则显著较弱。尽管多数配体强烈刺激表皮生长因子受体磷酸化，仅NRG-2β、BTC和EPR显著激活Akt，且这三种配体也诱导最强的MAP激酶激活。时程分析显示，NRG-2β呈现 prolonged的MAP激酶激活，1小时时仍保持50%最大效应，而EPG和EPR在中等水平。

代谢通量分析揭示两种反应模式：NRG-2β样反应（NRG-2β、EPG、EPR、BTC）和EGF样反应（EGF、TGFα、HB-EGF、AREG）。统计检验显示NRG-2β样配体组对所有检测代谢产物的刺激效应均显著强于EGF样配体组。核糖核苷酸通量结果一致，NRG-2β对所有四种核糖核苷酸的m＋1同位素异构体刺激最强，EPR、EPG和BTC也显著强于EGF等。

**与MDA-MB-468细胞的比较**

为验证配体偏向性是否为表皮生长因子受体固有属性，研究人员在MDA-MB-468细胞中重复实验。该细胞系高表达表皮生长因子受体但缺失ErbB4，ErbB2和ErbB3表达也较低。EGF处理后，MDA-MB-468细胞糖酵解通量增强，但磷酸戊糖途径中核糖-5磷酸通过非氧化途径广泛回收至糖酵解，而非用于核苷酸合成；EGF实际上抑制了¹³C进入核苷酸的通量，与该细胞系被EGF抑制生长的特性一致。重要的是，七种表皮生长因子受体配体均诱导相似水平的代谢通量变化，而NRG-2β无活性，即MDA-MB-468细胞中未观察到配体偏向性。蛋白质免疫印迹证实所有表皮生长因子受体结合配体均诱导 robust的受体磷酸化和MAP激酶激活，而NRG-2β无受体磷酸化且激活效应最弱。

此外，MDA-MB-468细胞中所有配体的MAP激酶激活均较MCF-7细胞更为持久，且配体间差异更为显著，如EPR在1小时保留70%峰值反应，而HB-EGF和BTC仅约35%。统计比较EGF样和NRG-2β样配体组显示，除α-酮戊二酸外，两组间无显著差异，这与MCF-7细胞形成鲜明对比。核苷酸通量分析同样支持MDA-MB-468细胞中不存在配体偏向性的结论。

**讨论**

研究人员在讨论部分深入分析了两种细胞系的代谢差异及其与配体偏向性的关系。MCF-7细胞和MDA-MB-468细胞对EGF的增殖响应截然相反——前者增殖而后者受抑，但两者均表现为EGF增强早期中间代谢通量。关键区别在于核糖-5磷酸的命运：MCF-7细胞优先用于核苷酸合成，MDA-MB-468细胞则通过非氧化途径回收至糖酵解。这种差异即使在无生长因子条件下即已存在，反映两种细胞系 basal状态下糖酵解和磷酸戊糖途径调控的根本不同。

配体偏向性的细胞依赖性是研究的核心发现。MCF-7细胞中存在NRG-2β样和EGF样两类反应，而MDA-MB-468细胞中所有表皮生长因子受体配体效应相似。这一发现挑战了"配体偏向性是受体固有属性"的传统观点，提示细胞内在特征对配体响应模式具有重要贡献。研究人员推测ErbB4是主要贡献因素：MDA-MB-468细胞高表达表皮生长因子受体而几乎无其他ErbB成员，信号输出几乎完全反映表皮生长因子受体同源二聚体的特性；MCF-7细胞表达低水平表皮生长因子受体和ErbB4，以及相对较高的ErbB2和ErbB3，形成更多样的二聚体组合，从而呈现复杂的配体响应谱。

BTC和EPR因能同时结合表皮生长因子受体和ErbB4，可诱导含ErbB4的多种二聚体，故产生NRG-2β样反应符合预期。但EPG仅结合表皮生长因子受体却能诱导NRG-2β样反应，研究人员推测这可能与EPG stabilizes 表皮生长因子受体胞外域的特定构象有关——该构象类似于组成性开放的ErbB2，而ErbB2作为专性异源二聚化伴侣，可能促使EPG结合的表皮生长因子受体倾向于与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体。相反，HB-EGF虽能结合ErbB4却呈现EGF样反应，可能因其优先诱导表皮生长因子受体同源二聚体而非ErbB4相关二聚体。

研究人员进一步指出，既往研究将配体偏向性与表皮生长因子受体二聚体胞外域构象差异相关联——高亲和力配体诱导对称二聚体，低亲和力配体诱导非对称、稳定性较差的二聚体；不同配体还导致胞内近膜域的不同二聚构象及C端尾自磷酸化位点的差异。本研究结果表明，这些结构性差异的生物学效应受细胞ErbB受体表达谱的调控。EGF和TGFα诱导的MAP激酶激活 transient，而EPG和EPR更为持久，这种差异曾被认为与细胞分化相关；但BTC虽诱导 transient激活却同样产生NRG-2β样代谢效应，提示二聚体伙伴选择而非MAP激酶动力学本身可能是决定分化命运的关键。

研究结论部分，研究人员总结强调：不同配体促进ErbB受体差异性二聚化并非新观点，但配体在二聚体伙伴选择中的作用直到近期才受到关注。EGF仅 weakly 刺激EGFR/ErbB4异源二聚化，而NRG-1 strongly促进该异源二聚化；NRG-1和BTC均优先诱导ErbB4同源二聚体而非ErbB2/ErbB4异源二聚体；AREG诱导表皮生长因子受体同源二聚体或EGFR/ErbB2异源二聚体的效能低于EGF、TGFα或BTC；BTC而非EGF可诱导EGFR/ErbB3异源二聚体和ErbB3磷酸化。本研究的发现进一步丰富了这一认识：ErbB系统中的信号转导可能是多种因素共同决定的复杂平衡，包括所有ErbB受体的绝对表达水平、受体间亲和力、配体对各受体的亲和力，以及配体优先促进特定ErbB受体二聚化的能力。该研究的重要意义在于，当解释与配体偏向性相关的数据时，必须考虑细胞中所有ErbB受体的相对表达水平——若配体偏向性涉及特定二聚体的优先诱导，则只有当相关ErbB受体存在时，这种偏向性才会显现出来。