选择性重新调控Met4泛素化机制可促进清酒酵母中S-腺苷甲硫氨酸的积累

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Selective rewiring of Met4 ubiquitin regulation enhances S-adenosylmethionine accumulation in sake yeast

　　

作者：Shogo Kakoi、Akira Nishimura、Hiroyuki Senjyu、Takuya Asai、Takahiro Akashi

所属机构：Hakutsuru Sake Brewing Co. Ltd. 研发部，地址：日本神户东灘区住吉南町4-5-5，邮编658-0041

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是一种含有硫的核心代谢物，既可作为通用的甲基供体，也可用于食品和制药领域。在Saccharomyces cerevisiae中，硫酸盐的代谢转化为甲硫氨酸和SAM的过程由转录因子Met4协同调控，而Met4的活性又受到Met30依赖的泛素化作用的影响。这种反馈机制在甲硫氨酸充足的情况下会抑制硫代谢相关基因的表达，从而限制甲硫氨酸-SAM代谢途径的代谢输入。虽然代谢工程通常针对单个酶步骤进行改造以增加SAM的积累，但直接调控这一转录枢纽的研究仍较为有限。在本研究中，我们构建了一种酿酒酵母菌株，该菌株表达了Met4 K163RΔInh变体，该变体将Lys163位点替换为Arg，并删除了与Met30相互作用的抑制区域。在甲硫氨酸添加条件下，这种工程化的Met4主要位于细胞核内，并能维持硫代谢相关基因的高表达水平。代谢产物分析显示，与对照菌株相比，甲硫氨酸/SAM循环相关代谢物的含量有所增加，这表明甲硫氨酸/SAM代谢途径的产出得到了增强。即使在营养丰富的培养基中，Met4 K163RΔInh菌株的细胞内SAM储备量也高于亲本菌株。综上所述，通过选择性重塑Met4的泛素化调控机制，可以构建出能够积累SAM的酿酒酵母菌株，这一方法补充了基于酶水平的硫衍生代谢物生产途径的工程改造。

章节摘录

培养基

本研究中使用的培养基包括合成最小培养基（SD）（含2%葡萄糖、0.5%硫酸铵和0.17%酵母氮源，不含氨基酸和硫酸铵 [Difco Laboratories, Detroit, MI, USA]）以及酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基（YPD）（含2%葡萄糖、1%酵母提取物 [Difco Laboratories] 和2%蛋白胨 [Difco Laboratories]）。所有培养基的pH值均调整为6.5。必要时，会添加500 μg/mL的G418（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）和25 μg/mL的诺斯托霉素（Jena）。

结果与讨论

为明确Lys163与Inh区域在甲硫氨酸响应性调控Met4中的作用关系，我们在单倍体酿酒酵母HL69（MATα）背景中生成了三个MET4等位基因：Lys163替换为Arg（Met4 K163R）、删除189–312位点的片段（Met4 ΔInh），以及同时包含这两种改变的双突变体（Met4 K163RΔInh）。在野生型（WT）和各突变体菌株的内源MET4基因位点上整合了N端GFP标签。随后我们分析了这些菌株中的GFP-Met4表达情况。

作者贡献声明

Shogo Kakoi：负责撰写初稿、实验设计、数据整理及概念构建。Akira Nishimura：负责撰写、审稿与编辑工作以及初稿撰写和数据整理。Hiroyuki Senjyu：负责项目管理和实验设计以及数据整理。Takuya Asai：负责撰写、审稿与编辑工作。Takahiro Akashi：负责撰写、审稿与指导工作。

致谢

本研究未获得任何公共机构、商业机构或非营利组织的资助。作者声明不存在利益冲突。