Ago1是裂殖酵母热应激下线粒体翻译调控所必需的

《Journal of Biological Chemistry》：Ago1 is required for the regulation of mitochondrial translation under heat stress in S. pombe

　　

线粒体蛋白合成是氧化磷酸化(OXPHOS)复合体的关键组分，对哺乳动物及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe，S. pombe)均至关重要。研究人员探究了热应激(heat stress)对线粒体的影响，分析了线粒体蛋白质组，发现热应激过程中所有线粒体DNA(mtDNA)编码转录本的翻译均受损，导致mtDNA编码蛋白稳态水平降低，表明热应激对线粒体蛋白合成具有普遍抑制作用。研究人员还发现热应激影响了线粒体翻译起始因子与线粒体核糖体小亚基(mt-SSU)的结合。有趣的是，ago1基因缺失补偿了热诱导的线粒体翻译起始因子与线粒体核糖体相互作用破坏，使S. pombe中mtDNA编码蛋白的翻译及稳态水平得到部分恢复。热应激下Ago1积聚于线粒体基质(matrix)，C端截短消除此定位且无法回补翻译抑制表型，证实线粒体靶向对其调控功能必不可少。此外，数据显示Ago1负载小分子RNA(small RNA)相关的N端结构域是热诱导翻译抑制所必需的，且Ago1与线粒体RNA(mtRNA)发生物理结合，共同提示线粒体内可能存在RNA干扰(RNAi)活性。这些发现揭示了热应激下线粒体蛋白合成调控的新机制。

Ago1是裂殖酵母热应激下线粒体翻译调控所必需的——论文解读

一、研究背景与意义

线粒体是真核细胞中进行氧化磷酸化(OXPHOS)产能的重要细胞器，其电子传递链复合体Ⅰ–Ⅴ中，除复合体Ⅱ完全由核基因组编码外，复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ均含有由线粒体DNA(mtDNA)编码的核心亚基（粟酒裂殖酵母S. pombe中为Cob1、Cox1–Cox3、Atp6、Atp8、Atp9及Var1）。这些mtDNA编码蛋白由线粒体自身翻译装置合成，其合成效率直接影响呼吸链功能。已有研究较多关注细胞质热激反应(heat shock response)，但对热应激如何影响线粒体蛋白合成及线粒体翻译的调控机制知之甚少。细胞核编码的因子是否参与热应激下线粒体翻译的适应性调控尚不清楚。Argonaute(AGO)蛋白是胞质RNA干扰(RNAi)通路核心组份，已有报道人源AGO2可定位于线粒体，但其在线粒体中的功能未明。该研究以S. pombe为模型，探讨热应激对线粒体翻译的影响及Ago1在此过程中的作用，论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。

二、主要关键技术方法

研究人员采用的主要方法包括：裂殖酵母野生型(WT)及ago1Δ、dcr1Δ缺失株、回补株及截短突变株的构建与培养（30℃正常及37℃热应激处理）；无标记定量线粒体蛋白质组学(Label-free LC-MS/MS)结合GO与KEGG富集分析；Western blot检测mtDNA编码蛋白(Cob1、Cox1–Cox3、Atp6等)及核编码对照蛋白(Cox4、Mrp5、Hsp60)；qRT-PCR检测mtRNA稳态水平；qPCR测定mtDNA拷贝数；Anisomycin存在下用[³⁵S]-Met/Cys脉冲标记线粒体翻译产物并经SDS-PAGE/放射自显影定量；蔗糖密度梯度离心结合免疫印迹分析线粒体核糖体亚基(mt-SSU、mt-LSU)组装及翻译起始因子Mti2/Mti3结合情况；线粒体分离与蛋白酶K保护实验确定Ago1基质定位；荧光显微镜观察Ago1-GFP与Cox4-RFP共定位；RNA免疫沉淀(RIP)结合qRT-PCR检测Ago1与mt-mRNA的物理互作；细胞色素c氧化酶(复合体Ⅳ)及泛醇-细胞色素c还原酶(复合体Ⅲ)活性测定。

三、研究结果

Global proteomic combined screening identifies heat stress impairs effects on S. pombe mitochondrial proteome regulation.

研究人员对30℃与37℃热应激处理的S. pombe进行线粒体蛋白质组学分析，鉴定到160个差异表达蛋白，其中83个显著下调。KEGG富集最显著的通路为氧化磷酸化(OXPHOS)，且多个mtDNA编码的OXPHOS亚基(Cox1、Cox2、Cox3、Atp8等)在热应激下丰度下降，提示热应激特异性影响线粒体编码蛋白水平。

Marked decrease in mitochondrial translation during heat heat stress.

Western blot显示热应激后Cob1、Cox1–Cox3、Atp6等mtDNA编码蛋白稳态水平显著降低，而核编码Cox4无明显变化。qRT-PCR显示mtRNA水平在热应激下未降反升，qPCR显示mtDNA拷贝数增加，排除转录或DNA拷贝数原因。用anisomycin抑制胞质翻译后[³⁵S]标记显示热应激下线粒体新生肽链合成显著减少，证明mtDNA编码蛋白下降源于线粒体翻译受抑。复合体Ⅲ和复合体Ⅳ酶活性在热应激下也显著下降。

Heat stress impairs the association of mitochondrial translation initiation factors with the mt-SSU.

蔗糖梯度离心显示热应激不影响线粒体核糖体小亚基(mt-SSU)、大亚基(mt-LSU)及完整线粒体核糖体的组装，但使线粒体翻译起始因子Mti2和Mti3从mt-SSU上解离，其与组装态线粒体核糖体的结合也减少，表明热应激通过破坏起始因子与mt-SSU的结合抑制翻译起始。

The mitochondrial translation can be restored by knocking out ago1。

ago1Δ和dcr1Δ缺失株在热应激下mtDNA编码蛋白稳态水平恢复至接近正常；ago1Δ使热应激下Cox1、Cox2、Cox3的[³⁵S]标记翻译信号部分恢复（Var1、Atp8、Atp9恢复有限），Ago1过表达则进一步抑制翻译。qRT-PCR证实ago1Δ不改变mtRNA水平，说明Ago1作用于翻译水平而非转录或RNA稳定性。

Ago1 is involved in regulating translation though disrupting the mitochondrial translate initiation during temperature stress。

在ago1Δ菌株中，热应激诱导的Mti3从mt-SSU解离被回补（Mti3与mt-SSU结合恢复），表明Ago1介导热应激对翻译起始因子与mt-SSU结合的破坏。

Evidence for the presence and interaction of Ago1 with the mitochondria。

热应激诱导Ago1蛋白表达上调，线粒体分离及蛋白酶K保护实验证实Ago1在热应激时转位至线粒体基质。C端截短(Ago1ΔC，缺失769–834 aa)丧失线粒体定位且无法回补热诱导翻译抑制，证明显粒体基质定位为其功能必需。N端截短(Ago1ΔN，缺失1–208 aa，small RNA装载结构域)虽能定位线粒体但不能抑制翻译，说明small RNA装载对Ago1调控功能必需。RIP-qPCR显示热应激下Ago1-FLAG与所有mtDNA编码mRNA显著结合。Dcr1-GFP在热应激时也出现线粒体定位趋势。

四、讨论与结论总结

研究人员得出结论：热应激使S. pombe中线粒体翻译起始因子Mti2/Mti3与mt-SSU解离，全局抑制mtDNA编码蛋白翻译；核编码的Argonaute蛋白Ago1（及Dicer同源物Dcr1）在热应激时转入线粒体基质，Ago1通过其N端small RNA装载结构域及与mt-mRNA的物理结合，参与破坏翻译起始因子与mt-SSU的关联，从而负调控线粒体翻译；ago1缺失可恢复起始因子结合及部分线粒体翻译，提示Ago1是热应激下线粒体翻译起始的负调控因子。该研究发现首次揭示Ago1参与热应激下的线粒体翻译起始调控及潜在的线粒体内RNAi样机制，为理解细胞在温度胁迫下通过核—线粒体通讯调控线粒体蛋白稳态提供了新视角。