α-烷基化α-氨基酸降低非折叠肽的聚集

《RSC Advances》：α-Alkylated α-amino acids reduce the aggregation of unfolded peptides

　　

异常聚集给生物活性肽的开发带来挑战。研究人员合成了蛋白质源性氨基酸的新型α-乙基化变体，并证明其通过不同于α-甲基化对应物的机制降低肽聚集。α-甲基化残基通过促进螺旋形成来减少聚集，而α-乙基化残基则在未促进二级结构的情况下阻止聚集。

研究背景与问题：肽类药物在生物技术和医学领域具有广阔应用前景，但必须采取特定构象才能发挥功能。未能正确折叠的肽和蛋白质易于发生异常聚集，形成富含β-片层（β-sheet）的组装体，这些聚集体通常高度热力学稳定，并能成核促进更多单体聚集，从而传播错误折叠状态。此类聚集不仅降低功能活性，还形成不溶性、异质性物质，阻碍生物活性肽的设计、表征和制剂开发。此外，聚集过程在生理或实验条件下可能不可逆，对储存、递送和结果可重复性构成重大挑战。主链烷基化是调控肽二级结构和聚集倾向的通用策略。N-甲基化可破坏淀粉样β-发夹形成并促进寡聚体结晶。α-碳烷基化提供互补调控手段，其中α-甲基化最为人熟知，能将主链φ和ψ二面角限制在Ramachandran图的螺旋区域，潜在促进α-螺旋形成并抑制延伸的β-片层。相比之下，α-乙基化的结构后果知之甚少。二乙基甘氨酸（Deg）是最广泛研究的α-乙基化残基，采取C5几何构型，倾向于延伸主链构象，能破坏β-片层和螺旋结构。然而，带有功能化侧链的α-乙基化氨基酸如α-Et-Glu和α-Et-Lys此前从未被整合入肽中，其对二级结构和聚集的影响尚属未知。α-烷基化既能偏置主链二面角，又能引入空间位阻以减少聚集倾向结构的形成，但烷基化带来的疏水性增加可能抵消这些效应。

研究设计与结论：研究人员合成并评估了α-乙基化功能氨基酸对肽结构和聚集的影响，发现α-甲基化和α-乙基化均能通过不同机制减少聚集倾向肽VW19的聚集，论文发表于《RSC Advances》。α-乙基化代表了一种与α-甲基化互补的防止肽聚集的策略，特别适用于需要维持延伸或无规构象的系统。α-乙基化残基可作为有用工具促进合成肽的非聚集状态，尤其适用于富含带电残基的合成天然无序肽设计。

关键技术方法：研究人员采用基于吗啉酮的立体选择性合成策略制备功能化α-乙基化氨基酸，通过α-酮酯衍生物与(2S)-苯甘氨醇缩合构建吗啉酮骨架，经Lewis酸促进的Grignard反应（EtMgBr）引入乙基取代基，再经氢解释放游离α-乙基化氨基酸；采用圆二色谱（CD）光谱学评估肽二级结构随温度的变化；采用浊度测定（600 nm吸光度）定量评估肽聚集程度；将α-烷基化氨基酸整合入TrpZipE模型肽，通过热变性CD监测（228 nm摩尔椭圆率）评估对β-片层形成的破坏作用。

研究结果：

VW19模型肽中的结构效应：为确定α-乙基化对肽结构和聚集的影响，研究人员将三种α-乙基化构件（α-Et-Val、α-Et-Glu和α-Et-Lys）或其α-甲基化对应物整合入构象转换肽VW19。该肽基于7残基卷曲螺旋重复序列（abcdefg模式），其中a和d位介导疏水卷曲螺旋相互作用，e和g位提供稳定化盐桥。野生型VW19在低温下形成α-螺旋卷曲螺旋，高温时转变为β-片层并不可逆聚集。CD光谱显示，VW19-WT在低于15°C时主要为无规卷曲，升温后转变为α-螺旋，约55°C时返回类无规卷曲状态，进一步加热转化为β-片层，冷却至5°C后保留β-片层结构。

α-甲基化残基稳定螺旋并防止聚集：与既往报道一致，α-甲基化残基整合显著稳定α-螺旋构象并防止聚集。VW19-αMe-Val^c和VW19-αMe-Lys^e在高达约75°C时维持稳定α-螺旋结构，冷却至5°C后完全恢复α-螺旋构象，此现象在野生型中未观察到。α-甲基化谷氨酸的效果具有位置依赖性：VW19-αMe-Glu^g在所有温度下保持无规卷曲，推测烷基化使侧链偏离有效盐桥形成所需构象；而将α-Me-Glu整合于非相互作用位点c（VW19-αMe-Glu^c）则恢复螺旋形成并防止高温β-片层转变。这些结果表明α-甲基化能将VW19的构象景观偏置向螺旋态，从而减少聚集倾向的β-片层构象的可及性。

α-乙基化残基破坏有序结构：α-乙基化氨基酸的整合产生与α-甲基化截然不同的效应。VW19-αEt-Val^c、VW19-αEt-Lys^e和VW19-αEt-Glu^g在整个加热-冷却循环中主要保持无规卷曲状态。VW19-αEt-Lys^e在85°C以上显示弱螺旋样光谱特征，但未形成明确α-螺旋结构（缺乏208 nm和222 nm特征负带）。这种有序结构的破坏独立于取代残基类型及其在卷曲螺旋序列中的位置；例如，Val14定向远离卷曲螺旋二聚体界面，故α-乙基化不太可能通过直接破坏二聚体界面来扰乱VW19折叠。研究人员将这种二级结构破坏归因于乙基取代基增加的空间需求，该需求可将主链二面角限制于与α-螺旋和β-片层几何均不相容的构象，这与先前二乙基甘氨酸以及α-乙基化Val和Ala的观察一致。因此，即使在单个组装体的单个残基的α-位增加单个亚甲基，也足以显著重塑折叠行为（从螺旋到延伸/无序构象）。

α-烷基化减少聚集：任何α-烷基化氨基酸的整合均足以减少这种聚集倾向肽的聚集。所有肽溶液加热至95°C并冷却回5°C后的浊度测量显示，仅VW19-WT出现可检测聚集，溶液在加热冷却后明显浑浊（P < 0.0001）。相反，所有α-甲基化和α-乙基化变体的浊度均未超过未加热野生型水平。聚集减少在各变体中一致，无论侧链类型（Val、Glu或Lys）、α-烷基取代基（甲基或乙基）或蛋白质中的位置（七肽重复中的c、e或g位）如何，尽管α-烷基化增加了疏水性。这些结果表明α-烷基化可作为促进甚至高度聚集倾向肽溶解度的最小化策略。

β-片层破坏机制验证：α-甲基化减少聚集可部分由其稳定二级结构的效应解释；α-甲基化增加了VW19的螺旋度，从而降低解折叠和随后向β-片层转变的倾向。然而，α-烷基化必须施加额外的聚集屏障，因为VW19-αMe-Glu^g和任何α-乙基化变体在任何温度下均未呈螺旋态。基于既往报道，研究人员假设α-烷基化通过破坏β-片层形成来减少聚集。为验证此假设，研究人员将α-烷基化氨基酸整合入色氨酸拉链（TrpZip）——一种特征明确的β-发夹肽。既往研究显示疏水侧链的α-乙基化残基能破坏β-片层形成，但α-乙基化氨基酸携带极性和/或带电侧链的行为尚不清楚。研究人员因此用α-Me-Glu或α-Et-Glu取代TrpZipE中的谷氨酸。与假设一致，两种取代均废止了β-片层折叠。这些结果表明α-烷基化氨基酸（包括α-乙基化变体）具有破坏β-片层形成的倾向。这种去稳定化可能源于改变的主链二面角和α-烷基取代基与伴侣β-链主链之间初生的空间位阻的组合效应。

研究结论翻译：总之，α-甲基化和α-乙基化均减少聚集倾向肽VW19的聚集，但通过部分分歧的机制。α-甲基化和α-乙基化氨基酸均阻止β-片层形成，同时α-甲基化稳定抵抗解折叠的α-螺旋构象，而α-乙基化则破坏α-螺旋和β-片层的形成，倾向于更无序或延伸的状态。这些结果表明即使微小的主链修饰也能显著重塑肽的构象景观并影响其聚集行为。总而言之，研究人员的发现表明α-乙基化代表了一种与α-甲基化互补的防止肽聚集的策略，特别适用于需要维持延伸或无序构象的系统。更 broadly，α-乙基化残基可作为有用的工具促进合成肽的非聚集状态，否则合成肽容易发发生有害聚集。这一方法可能特别适用于设计合成天然无序肽，这类肽通常富集带电残基，正如本文报道的那些。