人参皂苷Rg3直接靶向ORAI1调控钙信号及衰老相关AMPK-NRF2激活

《Journal of Ginseng Research》：Direct targeting of ORAI1 by ginsenoside Rg3 modulates calcium signaling and senescence-associated AMPK-NRF2 activation

　　

细胞衰老是由多种应激源引发的不可逆生长停滞状态，被认为是多种病理状况的主要危险因素，包括衰老相关疾病、癌症和代谢性疾病。减少氧化应激如活性氧（reactive oxygen species, ROS）已被认为是抑制细胞衰老的关键策略。近期研究进一步表明，细胞内钙信号在协调氧化应激反应和衰老相关表型中发挥关键作用。20(S)-人参皂苷Rg3（Rg3(S)）通过调节钙离子水平减少氧化应激，从而减轻细胞衰老。Panax ginseng Meyer（人参）长期以来被用作传统草药，主要消费形式为白参和红参。人参皂苷Rg3是人参中的主要生物活性皂苷，在红参中含量更为丰富。该化合物以S型和R型两种立体异构体形式存在，取决于碳20位羟基的取向，其中S型生物利用度更高。Rg3(S)具有广泛的生物活性，包括抗癌、抗炎、抗氧化作用，并通过促进细胞内钙内流抑制细胞衰老。然而，Rg3(S)调控钙信号的直接分子靶点及其在膜接触位点中的作用在很大程度上仍不清楚。

本研究旨在利用分子对接引导的突变分析，首次提供Rg3(S)与ORAI1结合界面的实验证据。研究人员采用人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts, HDFs）作为细胞衰老模型，通过钙成像和衰老相关β-半乳糖苷酶染色评估胞质钙水平和细胞衰老。利用邻近连接分析（proximity ligation assay, PLA）和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）分析质膜（plasma membrane, PM）-内质网（endoplasmic reticulum, ER）接触及相关蛋白相互作用。采用细胞热迁移分析（cellular thermal shift assay, CETSA）和微量热泳动（microscale thermophoresis, MST）验证Rg3(S)与ORAI1的直接结合。通过分子对接模拟和定点突变定义关键结合残基。

研究结果显示，Rg3(S)增加胞质钙水平，独立于ER钙耗竭，并伴随PM-ER接触的减少。Rg3(S)以剂量依赖性方式直接与ORAI1结合，确定ORAI1为人参皂苷Rg3此前未被识别的分子靶点。分子对接揭示ORAI1胞外环中的LYS²⁰⁴和ILE²²⁹为维持该相互作用的关键残基。这些残基的突变消除了Rg3(S)诱导的钙内流，导致AMPK-NRF2通路激活受损以及Rg3(S)抗衰老效应的减弱。

细胞衰老是多种病理状况的主要危险因素，包括衰老相关疾病、癌症和代谢性疾病。减少氧化应激和调控细胞内钙信号被认为是抑制细胞衰老的关键策略。20(S)-人参皂苷Rg3（Rg3(S)）作为人参中的主要生物活性皂苷，具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种生物学活性，但Rg3(S)调控钙信号的直接分子靶点及其在膜接触位点中的作用机制长期未明。尽管Rg3(S)被提议作为质膜钙离子通道ORAI1的配体，但两者物理相互作用的直接实验证据一直缺乏。此外，PM-ER接触位点通过ORAI1和STIM1调控钙通道活性的过程是否直接影响衰老相关细胞表型，也尚未被探索。因此，明确Rg3(S)的直接分子靶点和信号机制具有重要的科学意义。

本研究发表于《Journal of Ginseng Research》，研究人员综合运用CETSA、MST、分子对接模拟、定点突变、PLA、钙成像及SA-β-gal染色等技术，在人皮肤成纤维细胞和HEK293细胞中开展研究。样本来源为商业化的人皮肤成纤维细胞（原代细胞传至35代作为衰老模型）和HEK293细胞系。

**Rg3(S)减弱PM-ER相互作用，升高胞质钙内流**：通过Fluo-4-AM钙成像分析，研究人员发现Rg3(S)处理增强了人皮肤成纤维细胞中快速的胞质钙离子内流，而Mag-Fluo-4-AM染色显示ER钙水平未显著改变，证实Rg3(S)独立于ER钙耗竭升高胞质钙，其机制不同于经典钙库操纵性钙内流（store-operated calcium entry, SOCE）。PLA分析显示Rg3(S)显著减少ORAI1与STIM1标记的PM-ER接触，而ER-线粒体接触未受影响；多西环素作为阳性对照增强了ER-线粒体相互作用，验证了分析的特异性。免疫共沉淀进一步证实Rg3(S)处理后ORAI1-STIM1相互作用显著降低。这些发现表明Rg3(S)选择性破坏PM-ER接触，与增强的钙信号相关。

**Rg3(S)以剂量依赖性和特异性方式结合ORAI1**：在HEK293细胞中过表达Myc标记的ORAI1后，CETSA分析显示Rg3(S)以剂量依赖性方式在58°C下显著保留Myc-ORAI1的热稳定性，表明直接结合。MST分析确认Rg3(S)与ORAI1之间存在直接相互作用，测得解离常数（Kd）为134 nM。研究人员进一步比较结构相关的人参衍生化合物：20(S)-原人参二醇和 Compound K 与Rg3(S)共享甾体骨架但糖基化状态不同。CETSA结果显示Rg3(S)对Myc-ORAI1的稳定性增强作用最强，原人参二醇作用较弱，Compound K则无作用，突出了糖基化在高亲和性、选择性ORAI1结合中的关键作用。

**Rg3(S)与ORAI1结合机制分析**：分子对接分析初期针对ORAI1跨膜区和胞内区的模拟未获得稳定结合构象。鉴于Rg3(S)因亲水性糖基部分而膜通透性有限，研究人员假设其优先与ORAI1胞外域相互作用。针对跨膜结构域3和4之间胞外环的后续对接模拟鉴定了多个潜在相互作用残基，其中LYS²⁰⁴被预测与Rg3(S)的糖基部分形成氢键，而ILE²²⁹则与其四环核心结构发生疏水相互作用。定点突变构建的ORAI1^K204A和ORAI1^I229A突变体在CETSA分析中未显示Rg3(S)诱导的热稳定性增强，为对接预测提供了直接实验验证。

**ORAI1结合热点的功能验证**：在表达野生型ORAI1的细胞中，Rg3(S)处理显著增加胞质钙水平，而这一Rg3(S)诱导的钙内流在表达ORAI1^K204A或ORAI1^I229A突变体的细胞中被完全消除。时间进程分析显示，在毒胡萝卜素诱导ER钙库耗竭后，野生型细胞中钙再添加引发 robust 钙内流，Rg3(S)进一步增效；而突变体细胞未能显示增强的钙内流反应。在信号转导方面，Rg3(S)在野生型ORAI1细胞中诱导AMPK磷酸化和NRF2-HMOX1轴激活，但在突变体细胞中完全消失。CETSA证实Rg3(S)不直接作用于AMPK。此外，Rg3(S)在野生型细胞中减弱过氧化氢诱导的p21表达，但在突变体细胞中无此保护作用。SA-β-gal染色显示Rg3(S)显著减少野生型ORAI1细胞中的衰老细胞比例，而突变体细胞无保护效应。

**讨论**：本研究的主要目标是确定Rg3(S)的直接分子靶点和信号机制。研究人员整合配体-靶点相互作用验证方法，提供了Rg3(S)在生理相关条件下直接结合ORAI1的趋同证据。CETSA监测活细胞中化合物诱导的靶蛋白热稳定性变化，MST则通过测量复合物形成时的热泳行为变化精确定量分子结合，两者互补强化了ORAI1是Rg3(S)直接分子靶点的结论。

研究的一个重要概念性进展是发现人参皂苷衍生小分子对ORAI1的非经典调控模式。值得注意的是，Rg3(S)诱导的钙内流不符合经典SOCE范式：未观察到ER钙耗竭、PM-ER接触减少、ORAI1-STIM1相互作用减弱，但胞质钙内流增加。这些发现共同表明Rg3(S)促进STIM1非依赖性的ORAI1门控机制，提示Rg3(S)可能作为变构调节剂稳定ORAI1的开放或活性构象，独立于STIM1。这一机制与经典SOCE中STIM1结合是通道开放所必需的模式根本不同，表明胞外配体结合可直接重编程ORAI1门控行为。

研究将ORAI1确立为不仅是钙通道，也是可被小分子选择性调控的胞器间通讯结构调节因子。Rg3(S)代表了能够通过直接蛋白结合调控膜接触位点动态的独特天然化合物类别，为理解人参皂苷如何影响细胞信号和衰老提供了新的概念框架。

研究结论如下：这些发现确定ORAI1是人参皂苷Rg3(S)诱导的、与细胞衰老相关的钙信号的关键分子介导因子。通过调控PM-ER接触位点和胞质钙动态，Rg3(S)减轻细胞衰老，为人参衍生化合物的抗衰老潜力提供了超越自噬为中心通路的新机制认识。该研究重新定义了人参皂苷Rg3的抗衰老活性是直接分子结合ORAI1和重塑胞器间钙信号的结果，推进了对人参皂苷分子理解的进展，并突出了膜接触位点调控作为靶向衰老相关病理的有前景策略。