通过靶向SarA的γ-山竹素实现对MRSA生物污染的集成控制：一种绿色天然抗菌策略

《Journal of Hazardous Materials》：Integrated Control of MRSA Biological Contamination via SarA-Targeting γ-Mangostin: A Green Natural Antimicrobial Strategy

【字体：大中小】 时间：2026年06月06日 来源：Journal of Hazardous Materials 11.3

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　　强马|陈美诺|卓娜川|孙博彦|刘子墨|阿依尼加尔·朱莱蒂|王小梅|王思涵|姜海阳中国农业大学兽医学院，农业部与农村事务部兽医公共卫生与安全国家重点实验室，兽医药物残留和非法添加剂检测重点实验室，北京，100193，中国摘要耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）由于其显著的抗生素抗

强马|陈美诺|卓娜川|孙博彦|刘子墨|阿依尼加尔·朱莱蒂|王小梅|王思涵|姜海阳

中国农业大学兽医学院，农业部与农村事务部兽医公共卫生与安全国家重点实验室，兽医药物残留和非法添加剂检测重点实验室，北京，100193，中国

摘要

耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）由于其显著的抗生素抗性、多种毒力因子以及强大的生物膜形成能力，仍然是一个主要的公共卫生威胁，然而有效的综合抗菌策略仍然缺乏。全球调节因子SarA同时控制着这些关键的MRSA危害决定因素。在这里，我们报告了一个全面的平台，用于全面控制MRSA的生物污染，该平台基于无标记电化学阻抗谱（EIS）生物传感系统，旨在筛选针对SarA的抑制剂。利用这个平台，发现从水果中提取的黄酮类化合物γ-芒果苷（γ-MG）是一种有效的SarA抑制剂。进一步的分子动力学（MD）模拟显示，γ-MG能够自发且稳定地与DNA结合域内的残基（特别是VAL68和VAL92）结合，从而减弱结构波动。γ-MG显著降低了MRSA的存活能力（MIC=8 μg/mL），抑制了生物膜的形成，并有效消除了牛奶中的MRSA。γ-MG还淬灭了SarA的固有荧光，并在SarA修饰的金电极上引发了比阳性对照Morin（ΔZ′=1.614 kΩ）更大的阻抗响应（ΔZ′=6.442 kΩ）。转录组学和生物信息学分析显示，SarA调控的途径受到了广泛影响，包括转录活性、细胞粘附、应激反应和细胞壁稳态，这些变化与ΔsarA突变体的情况非常相似。动物感染模型证实了γ-MG对MRSA的治疗效果和去污能力。总体而言，这项研究为MRSA污染的综合预防和控制提供了一种有效的策略和敏感的分析工具。

引言

食源性金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种常见的食品污染细菌，由于能够产生耐热的肠毒素，因此在食品系统中构成了重要的生物危害。这些毒素可以在受污染的食品中持续存在，对食品安全和公共卫生构成重大风险。S. aureus是一种重要的食源性病原体，常与食品污染和食源性疾病爆发相关[1]。此外，它分泌多种毒力因子并具有形成生物膜的特性，进一步增加了感染的清除难度。特别是肠毒素的产生带来了严重风险，因为这些毒素在食品加工和烹饪过程中难以完全灭活，可能导致持续的食源性疾病[2]。此外，食品生产和加工中常用的保存方法（如酸处理和渗透压处理）容易诱导MRSA的交叉适应，大大增加了彻底清除细菌的难度[3]。因此，从源头上有效消除S. aureus至关重要，因为这可以减少肠毒素的产生和随后的食品安全风险。因此，迫切需要识别关键靶点并开发能够同时控制S. aureus毒力和生物膜形成的有效抗菌剂。

S. aureus的全球调节因子A（SarA）是一种DNA结合蛋白，它与目标基因启动子中的A/T富集保守序列区域结合形成二聚体，并通过下游基因直接或间接影响众多基因的转录[4],[5]。尽管SarA最初被认为主要参与毒力因子表达和生物膜形成的调控，但越来越多的证据表明，SarA在S. aureus的环境应激反应和适应性调控中也起着重要作用。通过调节多个全局调控系统及其下游基因网络，SarA有助于细菌在多种应激条件下的生理适应，包括氧化应激、营养限制、酸性环境和渗透压应激。先前的研究表明，SarA影响广泛的应激相关基因的转录，包括编码抗氧化防御酶的基因、参与代谢稳态的基因以及维持细胞膜完整性的基因[6]。一致地，< />缺失突变体表现出对氧化应激和宿主相关防御环境的显著降低的耐受性，突显了SarA在应激条件下维持细菌适应性和生存优势的重要性。此外，SarA还与几种经典的应激反应调节因子存在功能上的相互作用和调控耦合。例如，SarA可以通过影响agr、σ^B和codY调控途径，间接调节与能量代谢、应激防御和持久性表型相关的基因表达[7]。这种多层次的调控结构使SarA成为连接S. aureus毒力调控、生物膜发育和应激适应的中心枢纽。

电化学阻抗谱（EIS）作为一种强大的无标记技术，已被用于监测界面分子识别事件。由于其对应变传递电阻变化的高度敏感性，基于EIS的生物传感器已被广泛应用于细菌检测和病原体分析，表现出低检测限和快速响应时间[8],[9]。除了微生物检测外，EIS还越来越多地用于探测蛋白质-配体相互作用，并通过结合诱导的界面阻抗变化来筛选功能性小分子。尽管取得了这些进展，许多EIS平台的一个关键限制在于对电极表面蛋白质固定控制和理解的不足。蛋白质通常随机吸附或非特异性地与金电极结合，这可能导致定向不均一、活性域部分掩盖以及信号变化。由于阻抗响应本质上对界面结构敏感，缺乏结构洞察力限制了机制解释和重复性。分子动力学（MD）模拟提供了蛋白质-表面相互作用的原子级理解，并揭示了吸附定向和残基特异性相互作用对金表面功能域暴露的影响[10],[11]。然而，将基于MD的界面分析与基于EIS的抑制剂筛选相结合的研究仍不充分。

在这里，我们建立了一个全面的平台，用于全面控制MRSA的生物污染，该平台基于无标记电化学阻抗谱（EIS）生物传感系统，旨在筛选针对SarA的绿色抑制剂。利用这个平台，发现γ-芒果苷（γ-MG）是一种有效的SarA转录抑制剂。通过肉汤稀释法、生长曲线和时间杀灭试验评估了其抗菌活性，而通过晶体染色法评估了其生物膜抑制作用。进一步的MD模拟提供了关于SarA-γ-MG相互作用的构象和能量学见解。荧光淬灭和EIS测量进一步证实了γ-MG与SarA之间的直接结合。转录组测序结合基于GEO的相关性分析表明，γ-MG诱导的转录重编程与ΔsarA突变体的情况非常相似，支持了在系统水平上的靶点特异性抑制。使用食品污染和感染模型进一步评估了γ-MG的去污效果。

章节片段

SarA的表达和纯化

以中国宁夏分离的MRSA W19（原始牛奶样本）的基因组DNA为模板，通过PCR扩增基因，并在两端引入了限制性位点和保护碱基。上游引物：5’-CGCCATATGGCAATTACAAAAATCAATGAT-3’，下游引物：5’-CCGCTCGAGTCATTATAGTTCAATTTCGTT-3’。通过双酶切和连接构建了重组表达质粒pET28a(+)-sarA。重组质粒的构建和验证也通过双酶切和凝胶回收完成。

筛选平台的建立和天然产物抑制剂的发现

建立全面的筛选平台和工作流程是高效发现抑制剂的前提（图1）。在这项研究中，基于文本和数据库挖掘，建立了一个包含4×10³种天然产物的本地数据库，并根据SarA的晶体结构（PDB ID: 2FRH）进行了虚拟筛选，经过3轮分子对接后，筛选范围缩小到50种分子。

结论

本研究建立了一个全面的平台，通过针对其调控的“阿喀琉斯之踵”——全球调节因子SarA，实现了对MRSA生物污染的综合控制。开发了一种基于无标记电化学阻抗谱（EIS）的生物传感系统，用于高效筛选天然抗菌剂，从而鉴定出γ-MG作为有效的SarA抑制剂。通过直接与DNA结合域内的关键残基结合，γ-MG干扰了SarA介导的

遵守伦理要求

所有动物实验方案均获得了中国农业大学基因技术机构动物护理和使用委员会的批准（SYXK, 2018–0044）。涉及小鼠的实验程序也获得了批准（AW22301202-2–1）。

环境影响

食源性耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）由于其多重耐药性、毒素产生和强生物膜形成能力，能够在食品链中持续存活和传播，对环境和食品安全构成重大威胁。全球调节因子SarA作为控制毒力、生物膜形成和应激适应的中心转录枢纽，代表了MRSA的“阿喀琉斯之踵”。在这里，我们提出了一个集成的EIS/MD驱动平台，用于

CRediT作者贡献声明

王小梅：数据整理。王思涵：写作——审稿与编辑、方法学、资金获取、概念构思。孙博彦：方法学、数据整理。刘子墨：验证、方法学。卓娜川：方法学。强马：写作——初稿、验证、方法学、概念构思。陈美诺：验证、方法学。姜海阳：写作——审稿与编辑、监督、项目管理。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金青年科学基金项目（编号32402980）和中国农业大学URP大学生创新培训项目（X2024100190127）的支持。

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