发现并开发了一种源自堆肥的嗜热BHET酶，用于增强消费后PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）的降解效果

《Journal of Healthcare Quality Research》：Discovery and engineering of a compost-derived thermophilic BHETase for enhanced depolymerization of post-consumer PET

　　

周晓丽|李贤|臧毅|周莲|冯光达|邓明荣|朱红辉

广东省微生物培养与应用重点实验室，农业微生物组学重点实验室（MARA），农业微生物组学与精准应用重点实验室（MARA），中国南方应用微生物学国家重点实验室，广东省科学院微生物研究所，广州510070，中华人民共和国

摘要

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）废物的积累迫切需要可持续的回收技术。酶促解聚是一种环保的方法，但其效率经常受到产物抑制的影响，因为积累的寡聚中间体（如双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（BHET）会抑制降解PET主链的水解酶的活性。在这里，我们报道了一种来自堆肥来源的嗜热细菌的热稳定BHET酶的鉴定和工程改造，并展示了其与代表性角质酶ICCG的协同使用，以高效降解未经处理的消费后PET瓶。通过在60°C下以PET为唯一碳源进行富集培养，我们分离出了Geobacillus sp. Z231菌株。通过基因组测序和分泌组分析，我们鉴定出一种名为gsBHETase的热稳定酯酶。这种酶表现出显著的BHET水解活性，其催化效率是ICCG的5.5倍，是IsPETase的6.3倍。工程改造后的变体M3的最适温度显著提高（从60°C提高到85°C），长期稳定性极佳（在60°C下28天后仍保持70%以上的活性），并且PET水解活性比野生型酶提高了2.6倍。值得注意的是，当与ICCG结合使用时，变体M3将未经处理的消费后PET瓶的降解效率提高了3倍。这项研究不仅提供了一种强大的热稳定BHET酶作为有前景的生物催化剂，还建立了一个协同的双酶系统，克服了寡聚物水解的限速步骤，为绿色和高效的PET生物回收铺平了道路。

引言

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料废物的环境积累是一个紧迫的全球性问题，这推动了人们对可持续和高效率回收技术的迫切需求[1]。作为制造量最大的聚酯之一，PET广泛用于包装、纺织品和饮料瓶，每年产生数百万吨的塑料废物[2]。尽管已经开发了机械和化学回收方法，但这些方法通常能耗高、操作条件苛刻，或者产生的再生材料性能较差[3]、[4]。相比之下，酶促解聚作为一种有前景的绿色替代方案受到了广泛关注，它可以在温和的反应条件下选择性地将PET降解为其基本单体对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG），从而有助于发展PET废物的闭环循环经济[5]、[6]。

从Ideonella sakaiensis 201-F6中鉴定出的PETase（IsPETase）是一个重要的里程碑，表明微生物已经进化出了能够在常温条件下水解这种难降解聚酯的催化机制[7]。这一开创性的发现激发了人们对高度稳定和催化效率高的PET水解酶的发现和定向进化的密集研究[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。此后，这一领域取得了实质性进展，产生了一系列高性能酶，包括叶枝堆肥角质酶（LCC）及其工程变体，这些酶在接近PET玻璃化转变温度（Tg）的高温下表现出出色的水解活性[15]、[16]、[17]、[18]。例如，合理设计的ICCG变体在72°C下能够将无定形或预处理的PET底物降解超过90%，这是塑料废物生物回收领域的一个重大进展[17]。

尽管取得了这些显著进展，但PET的完全和高效酶促水解仍是一个多步骤的催化过程。以I. sakaiensis的双酶系统为例，PETase最初会切割PET主链，生成可溶性的寡聚中间体，主要是单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（MHET）和双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（BHET），这些中间体需要进一步通过专门的次级酶（如MHETase）进行水解才能完全单体化[19]、[20]。尽管已经投入了大量努力来工程改造能够有效攻击PET聚合物链的酶，但可溶性寡聚中间体的下游水解通常是一个关键的动力学瓶颈，限制了整体解聚效率[21]。特别是MHET和BHET的积累被认为是限制酶促PET解聚整体效率的关键因素，主要是因为它们对主链水解酶的产物抑制[22]。系统的动力学研究表明，产物积累显著减缓了反应进程，不同酶对MHET和TPA的抑制作用各不相同[23]。因此，最近专注于增强中间体水解的策略显著提高了整体PET降解效率[24]、[25]、[26]。因此，能够有效靶向和降解BHET（主要二聚体中间体）的酶是高性能PET降解酶系统不可或缺的组成部分。高活性的BHETase可以与主链切割酶协同作用，通过快速消除积累的寡聚物来减轻反馈抑制，从而显著提高整体催化效率[27]、[28]。之前已经鉴定和工程改造了几种用于PET解聚的BHETase[29]、[30]、[31]、[32]。值得注意的是，李等人从Chryseobacterium和Bacillus subtilis中发现了BHETase，并展示了它们在双酶系统中改善PET回收的实用性[27]。这项工作突显了将BHETase与PET水解酶结合以提高整体单体产量的潜力。

尽管取得了这些进展，但天然BHETase的多样性仍然很大程度上未被利用，通过合理设计和定向进化来优化它们以促进大规模PET回收仍有巨大潜力。因此，发现和工程改造具有优异BHET水解性能的新生物催化剂至关重要，特别是那些在高温下保持高稳定性和活性的催化剂，这对于实现快速PET解聚是最理想的[28]。将一种强大的主链解聚酶与高活性和热稳定的BHETase作为辅助酶结合的协同策略，对于克服现有瓶颈和推进酶促PET回收的实际应用具有巨大前景。

在本研究中，我们旨在通过使用PET作为唯一碳源从堆肥中富集嗜热微生物群落来解决这一需求。通过结合基于活性的筛选、基因组测序和分泌组分析的综合性方法，我们成功鉴定出一种新的嗜热Geobacillus菌株及其编码的BHET水解酶，命名为gsBHETase。这种酶表现出优异的BHET水解活性，其催化效率是ICCG的5.5倍，是IsPETase的6.3倍。为了进一步提高工业适用性，我们使用蛋白质工程技术生成了gsBHETase的变体。值得注意的是，变体M3的最适温度显著提高（从60°C提高到85°C），在60°C下培养28天后仍保持70%以上的初始催化活性，并且PET水解活性提高了2.6倍。关键的是，我们证明了gsBHETase及其工程改造后的M3变体与基准角质酶ICCG具有协同作用。将这些BHETase添加到ICCG催化的反应中，使未经处理的消费后PET瓶的水解效率提高了3倍。总体而言，这项工作不仅介绍了一类新的高性能热稳定BHET酶，还提供了有力的概念证明，表明协同的多酶系统是实现绿色、高效和可扩展的消费后PET废物生物回收的优越策略。

章节片段

材料

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）从Macklin（中国上海）购买。双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（BHET）、单(2-羟乙基)对苯二甲酸（MHET）和对苯二甲酸（TPA）从Aladdin（中国上海）购买。PET半结晶薄膜和微塑料样品按照先前报道的方法制备[8]。实验用堆肥样品收集自中国韶关的一个农田（24.723666N, 113.477707E），并储存在4°C。

富集嗜热PET降解菌群并分离BHET水解的Geobacillus菌株

为了鉴定能够水解PET及其寡聚中间体的新型嗜热酶，我们在60°C下使用堆肥作为接种物和PET作为唯一碳源进行富集培养。经过三个月的三次连续转移后，对每一轮获得的富集培养物进行了16S rRNA基因扩增子测序，以表征富集微生物群落的分类结构。

结论

在这项研究中，我们成功从堆肥来源的微生物群落中鉴定并工程改造了一种新的嗜热BHETase，并展示了其与基准角质酶ICCG的协同应用，以高效降解未经处理的消费后PET瓶。通过基于活性的筛选、基因组测序和分泌组分析的综合性方法，我们从Geobacillus sp. Z231中鉴定出了gsBHETase。蛋白质工程产生了突变体M3，其

环境影响

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）废物已成为一种普遍的环境污染物，与微塑料形成和生态风险相关。传统的回收方法能耗高且会造成二次污染，这突显了对可持续解决方案的需求。在这里，我们开发了一种协同的酶促方法，用于高效降解实际的PET废物。来自堆肥的热稳定BHETase（gsBHETase）及其工程变体M3表现出优异的热稳定性和催化

CRediT作者贡献声明

周晓丽：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，研究，资金获取，概念化。冯光达：监督。周莲：研究。臧毅：研究。李贤：方法学，研究。朱红辉：监督，资金获取。邓明荣：监督。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢广东省乡村振兴战略专项资金（2022-440000-4301030403-9538）的种子产业振兴项目，以及GDAS的科技发展项目（2022GDASZH-2022010101）的支持。