《Journal of Infection》：Metagenomic sequencing as a diagnostic tool for urine culture negative febrile urinary tract infection
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目的
抗菌药物预处理会妨碍通过尿培养对发热性尿路感染进行诊断。本研究考察了在血培养阳性但尿培养阴性的发热性尿路感染患者中，尿液宏基因组学（metagenomics）用于诊断的价值。
方法
研究人员对41份培养阳性和19份培养阴性的发热性尿路感染患者尿液样
目的
抗菌药物预处理会妨碍通过尿培养对发热性尿路感染进行诊断。本研究考察了在血培养阳性但尿培养阴性的发热性尿路感染患者中，尿液宏基因组学（metagenomics）用于诊断的价值。
方法
研究人员对41份培养阳性和19份培养阴性的发热性尿路感染患者尿液样本进行了鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing），并将尿液宏基因组结果与血培养和尿培养结果进行比较，同时纳入抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility testing，AST）。采用mOTUs3.1进行宏基因组病原体检测，采用ResFinder2.0进行抗菌药物耐药（antimicrobial resistance，AMR）基因检测（标准参数设置）。对尿培养阴性样本对应的血培养分离株进行了全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）。使用BWA-MEM和sylph将宏基因组病原体序列读段比对至各自对应的WGS组装序列。
结果
宏基因组学在41/41? 不对，实际为39/41份培养阳性尿液样本和17/19份培养阴性尿液样本中检出了血培养分离株。19例尿培养阴性患者中有11例接受了抗菌药物预处理，而41例尿培养阳性患者中为8例。血培养分离株在33/41份培养阳性和15/19份培养阴性尿液样本中是丰度最高的病原体。病原体特异性宏基因组读段比对到其WGS组装序列的比例中位数为93.2%，平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）中位数为98.7%（n=11）。基因型AMR检测与表型AST的一致率为38%–96%。
结论
尿液宏基因组学能够成功检出尿培养阴性发热性尿路感染患者中的致病病原体。基因型AMR预测仍需进一步研究。
本文发表于《Journal of Infection》，研究聚焦于发热性尿路感染（febrile urinary tract infection，fUTI）在常规诊断中的关键困境：临床上为防止病情进展为尿源性脓毒症，往往在高度怀疑感染时即刻给予经验性抗菌治疗，但这会显著降低尿培养阳性率，使部分真实存在的fUTI患者出现“血培养阳性、尿培养阴性”的诊断断裂。传统半定量尿培养及其后续抗菌药物敏感性试验（antimicrobial susceptibility testing，AST）依赖细菌生长，一旦采样发生在抗菌药物使用之后，就容易出现无生长或结果不确定，不仅削弱病原学确证，也妨碍后续抗菌药物管理，例如由广谱静脉治疗向窄谱口服方案的精准转换。因此，寻找不依赖活菌培养、可直接从尿液中识别病原体并评估耐药性的分子诊断策略，具有明确的临床必要性。
基于这一背景，研究人员提出，若fUTI患者血培养检出病原体，则该病原体高度可能代表本次感染的致病菌，可作为评价尿液宏基因组检测性能的参照标准。为此，研究纳入荷兰7家医院2003年12月至2014年6月期间3项临床试验中的成年社区获得性fUTI患者，限定为血培养阳性者，并选取全部有剩余冻存尿样的尿培养阴性患者19例，以及按1∶2比例随机抽取的尿培养阳性患者41例，共60例。研究核心目标有二：其一，评价尿液鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing）对致病病原体的检出能力，尤其是在尿培养阴性情况下的表现；其二，探索尿液宏基因组在抗菌药物耐药（antimicrobial resistance，AMR）基因预测方面与表型AST的一致程度。
方法上，研究人员对尿液样本进行DNA提取、无PCR文库构建及Illumina HiSeq4000双端150 bp测序，目标测序深度为每样本300万对读段；设置阴性对照、内参对照、模拟菌群对照及阳性提取对照，以监测污染、交叉污染及检测下限。去除低质量和人源序列后，使用mOTUs3.1进行物种注释，并依据既往文献范围综述将细菌划分为病原体或非病原体。对于尿培养阴性患者可获得的11株血培养分离株，进一步实施全基因组测序（whole genome sequencing，WGS），并以BWA-MEM和sylph评估尿液宏基因组读段与血培养分离株基因组之间的核苷酸一致性；同时采用ResFinder4.1识别尿液宏基因组和血培养分离株WGS中的AMR基因，并与血、尿培养的表型AST结果比较。统计分析还纳入稳健CLR转换、Aitchison生态距离、非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）及ANOSIM，用于比较尿培养阳性与阴性患者尿液微生物组结构是否存在系统差异。样本来源为荷兰7家医院3项前瞻性收集临床资料的试验队列，当前研究为回顾性分析。
研究结果首先表明，尿液宏基因组测序具备较高的病原体检出能力。在41份尿培养阳性样本中，宏基因组检测到培养病原体39份，其中33份样本中该病原体为丰度最高的病原体；其余多数样本中，该病原体仍位列前3丰度病原体之中。对应血培养病原体在尿液宏基因组中的相对丰度中位数为81.1%。这说明在常规尿培养已阳性的fUTI患者中，宏基因组方法能够较稳定地重建病原学图谱，并在大多数情况下把真实致病菌定位为优势菌。
更重要的是，在“Patients with a positive blood culture but a negative urine culture”这一部分中，研究显示尿液宏基因组对于尿培养阴性病例同样具有重要价值。在19份尿培养阴性样本中，宏基因组检出了17份对应的血培养病原体，其中15份中该病原体为最丰富病原体，另2份虽与其他病原体丰度相近，但仍位列前3位。其相对丰度中位数为57.1%。这一结果直接支持论文核心结论：即便在传统尿培养失败时，尿液宏基因组仍可识别多数fUTI患者的致病菌。值得注意的是，尿培养阴性组中抗菌药物预处理比例显著更高，为11/19，而尿培养阳性组仅8/41，提示培养阴性很可能与预先用药相关，而宏基因组方法在此情境下具有补位作用。
在“Comparison of urine metagenomics between patients with a positive and a negative urine culture”部分，研究人员进一步比较了两组样本的微生物组结构。虽然尿培养阴性组血培养病原体的中位相对丰度低于尿培养阳性组，且接受抗菌药物预处理者也呈现较低病原体丰度，但差异未达到统计学显著性。更关键的是，基于稳健Aitchison距离和NMDS的分析未观察到尿培养阳性与阴性样本之间的聚类分离；按照性别、入院时抗菌药物预处理、复发性尿路感染、导尿管使用、既往6个月抗菌药物应用及糖尿病状态分组时，同样未见明显群组差异。ANOSIM统计量R为-0.13，p=0.98，提示两组尿液微生物组整体上不可区分。该结果从群落结构层面支持作者的假设：尿培养阴性与阳性患者很可能来自同一总体，尿培养阴性并不意味着不存在相关病原体，而更可能反映培养方法在特定临床条件下灵敏度受限。
在病原体身份验证方面，研究利用可获得WGS数据的11例尿培养阴性患者开展了更深入分析。病原体特异性宏基因组读段比对至相应血培养分离株WGS组装序列的比例中位数达到93.2%，ANI中位数为98.7%。这一结果说明，尿液宏基因组中识别到的病原体读段与血培养分离株在核苷酸水平上高度一致，从而增强了“宏基因组确实检出了同一致病菌”的证据强度，而非仅仅识别到同属或同种的背景菌。
在“Genotype to phenotype comparison of antimicrobial resistance detection”部分，论文则展示了另一面：AMR基因型推断尚不足以直接替代表型药敏。血培养分离株WGS与血培养表型AST之间的一致率因药物而异，为60%–80%；尿液宏基因组AMR预测与血培养AST的一致率平均为59.4%，与尿培养AST相比平均为74.7%，不同药物类别之间差异明显。第三代头孢菌素的基因型-表型一致性较高，而阿莫西林/克拉维酸（co-amoxiclav）的一致性尤其差，存在较高的极严重错误率（very major error，VME），即表型耐药但未检出相应AMR决定因子。研究还发现，对于WGS中存在但ResFinder在宏基因组数据中未识别出的19个AMR基因，采用BWA直接比对后又额外检出17个，只是读段数很低，提示标准参数下的工具灵敏度受限，低丰度耐药基因易被漏检。这表明当前宏基因组AMR预测受限于病原体读段深度、人源DNA背景、数据库完整性以及耐药表达调控机制认知不足，仍难满足临床常规替代AST的要求。
讨论部分强调，本研究的独特优势在于同时拥有血培养和尿培养信息，使研究人员能够在尿培养阴性病例中依托血培养结果锚定“致病病原体”，从而较为可靠地评估尿液宏基因组的诊断能力。这一点是既往多数比较尿液宏基因组与尿培养研究所欠缺的。研究也指出局限性，包括尿培养阴性样本因需有剩余冻存尿液而可能存在选择偏倚；样本跨越14年，EUCAST断点年度更新可能造成部分表型AST异质性；样本冷冻保存可能导致DNA降解；另外，对革兰阳性菌的裂解和回收效率可能偏低，提示样本前处理流程仍需优化。尽管如此，整体数据仍一致表明：在接受抗菌药物预处理、从而尿培养易阴性的fUTI患者中，尿液宏基因组对致病菌的检出优于传统尿培养，并且在尿培养阳性与阴性患者中的病原体识别表现总体相近。
研究结论部分可译为：研究显示，宏基因组学能够在尿培养阴性的发热性尿路感染患者中检出致病病原体，而这部分患者中有相当比例曾接受抗菌药物预处理。尿液宏基因组学在这一患者群体中可能尤其具有应用价值，研究结果支持进一步开展将宏基因组检测与患者临床结局相联系的临床研究。
