《The Journal of Molecular Diagnostics》：Pitfalls in detecting MET exon 14 skipping variants by DNA- and RNA- based next generation sequencing technologies in a large real-world cohort and results of the first multinational EQA schemes
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卡琳娜·海特（Carina Heydt）|米凯拉·安吉丽卡·伊勒（Michaela Angelika Ihle）|卡塔琳娜·伊尔姆（Katharina Ilm）|扬·雷克（Jan Rehker）|佩奥妮·普恩（Peony Poon）|雅娜·西曼诺夫斯基-赫拉赫（Janna Siemanowski-Hrach）|罗伯托·帕佩施（Roberto Pappesch）|斯文雅·瓦格纳-里切克（Svenja Wagener-Ryczek）|克里斯托夫·乔纳斯（Christoph Jonas）|雅娜·法松克（Jana Fassunke）|理查德·里德尔（Richard Riedel）|安妮·玛丽亚·舒尔特海斯（Anne Maria Schultheis）|莱因哈德·布特纳（Reinhard Buettner）|萨宾·默克尔巴赫-布鲁塞（Sabine Merkelbach-Bruse）|乌多·西博尔茨（Udo Siebolts）
德国科隆大学医学院及科隆大学医院病理学研究所
摘要
MET外显子14跳跃突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中是靶向治疗的重要生物标志物，因此准确检测这些突变至关重要。我们使用基于DNA和RNA的下一代测序（NGS）技术分析了379例具有MET外显子14及其相邻剪接位点突变的NSCLC样本。这379个样本中共发现了171种不同的MET外显子14突变，体现了这些突变的多样性。其中114种突变同时通过DNA和RNA NGS方法进行了检测。两种大的缺失突变以及一种导致外显子14跳跃的同义剪接位点突变仅通过RNA NGS方法被检测到。7种MET外显子14的单核苷酸变异并未引起跳跃现象。由于样本材料不足或RNA质量不佳，有57种变异无法通过RNA NGS方法进行分析；其中18种为先前已报道的跳跃突变，30种为剪接位点的插入/缺失突变，9种尚未分类。
此外，还展示了由主要研究机构Quality in Pathology GmbH组织的针对福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织及液体活检样本中MET外显子14跳跃突变的第一个多国外部质量评估方案的数据。结果显示，FFPE组织的检测成功率较高（98%），而液体活检的检测成功率较低（2022年为37.5%，2024年为63%），主要原因是等位基因比例低和内含子缺失。
本研究强调了同时分析DNA和RNA的重要性，并呼吁提高检测方法的灵敏度、覆盖范围和生物信息学水平。
引言
MET外显子14跳跃突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中的发生率为3–4%，且具有高度异质性[1]。这些突变已成为NSCLC患者的重要可操作生物标志物。美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）已批准酪氨酸激酶抑制剂（TKI）特波替尼（tepotinib）和卡马替尼（capmatinib）用于治疗具有MET外显子14跳跃突变的晚期NSCLC患者[2, 3]。
MET外显子14跳跃突变首次引起关注是在2015年，当时大规模研究显示IV期肺腺癌患者携带多种MET外显子14剪接变异，这些变异导致MET外显子14丢失并进而激活MET[4, 5]。
迄今为止，已描述了超过100种可能导致MET外显子14跳跃的突变类型[6]。这些突变包括单核苷酸变异、缺失、插入、组合缺失/插入以及重复，它们会破坏MET外显子14 5’端的剪接受体或3’端的剪接供体位点[7]。
MET外显子14跳跃突变可以在DNA或RNA水平上被检测到。目前，最常用的检测方法是基于扩增子或杂交的下一代测序（NGS）技术。在DNA水平上，可以根据人类基因组变异协会（HGVS）的命名规则确定导致MET外显子14跳跃的具体突变；然而，剪接效应、外显子14转录的丢失以及融合产物的生成只能通过RNA检测方法或功能研究来评估[1, 8, 9]。为了可靠地检测所有MET外显子14跳跃突变，需要质量可靠且灵敏度高的检测方法。方法标准化以及内部和外部质量评估对于确保分子检测的准确性和重复性至关重要，尤其是在分散式检测的情况下[10]。
本研究分析了2016至2024年间收集的379例NSCLC样本，这些样本具有MET外显子14的剪接位点突变，同时采用了基于DNA和RNA的NGS技术，并指出了这两种方法的局限性。此外，还展示了与德国柏林Quality in Pathology (QuIP) GmbH合作开展的针对福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织及液体活检样本中MET外显子14跳跃突变的第一个多国外部质量评估方案的结果。
章节片段
肿瘤样本
本研究回顾了379份FFPE NSCLC组织样本，这些样本在分子病理学常规诊断中已被检测出MET外显子14及其剪接位点的突变。这些样本选自2016年至2024年间德国科隆大学医院病理学研究所的数据库。所有样本均按照当地规范进行了处理。所有实验均遵循相关指南和法规进行。
基于RNA的NGS检测方法的灵敏度分析
Archer FusionPlex lung检测方法（IDT）的技术灵敏度通过系列稀释实验确定（图1）。该检测方法能够检测到稀释比为1:20的商业参考材料中的MET外显子14跳跃突变。Archer FusionPlex lung检测方法（IDT）推荐的输入量为200 ng tNA，不受肿瘤细胞含量的影响。在我们的实验中，该方法的检测限为10 ng突变tNA，相当于26个支持融合的读段。
讨论
在NSCLC中检测到的MET突变数量不断增加，这表明编码的受体酪氨酸激酶在靶向治疗中的重要作用。因此，对NSCLC患者进行常规检测已成为标准做法。尤其是自从FDA和EMA批准了针对具有MET外显子14跳跃突变的晚期NSCLC患者的MET抑制剂之后。
本研究评估了379例具有MET外显子14突变的NSCLC样本。这些样本中共包含171种不同的MET外显子14突变
致谢
我们感谢参与QuIP GmbH组织的多国外部质量评估（EQA）子方案的各个研究机构：
