《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Milk-Derived Bioactive Peptides as Prospective ERK2 Inhibitors: A Computational Screening Strategy Toward Anticancer Therapeutics
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Nahlah Makki Almansour | Mahmoud A.A. Ibrahim
沙特阿拉伯哈夫尔阿尔巴廷大学科学学院生物系，哈夫尔阿尔巴廷1803
摘要
ERK2在病理和正常条件下调节细胞信号传导中起着关键作用。ERK2对人类发育至关重要，但其过度表达会显著促进癌
Nahlah Makki Almansour | Mahmoud A.A. Ibrahim
沙特阿拉伯哈夫尔阿尔巴廷大学科学学院生物系，哈夫尔阿尔巴廷1803
摘要
ERK2在病理和正常条件下调节细胞信号传导中起着关键作用。ERK2对人类发育至关重要，但其过度表达会显著促进癌细胞的增殖。选择性抑制ERK2的一种可行方法是关注蛋白质-蛋白质相互作用，特别是基于肽的D-招募位点（DRS）的抑制。在这方面，研究人员探索了牛奶生物活性肽数据库，这是一个包含来自多种物种的肽序列的综合性数据库，并从中筛选出108种具有已知抗癌和抗氧化活性的肽，随后对其与ERK2 DRS的结合进行了研究。最初使用可获得的实验数据评估了HADDOCK 2.4软件预测肽-ERK2对接模式的能力。通过计算这些牛奶来源肽与ERK2 DRS的对接得分，排名靠前的肽被选中进行分子动力学（MD）模拟，并结合MM-GBSA方法计算结合能（ΔG-binding）。根据MM-GBSA//200 ns MD模拟的结果，肽41和49的结合亲和力优于参考肽KIM-MAP3，其ΔG-binding值分别为-57.3、-52.8和-51.5 kcal/mol。回转半径和每帧结合能分析进一步证实了这些肽在200 ns MD模拟过程中与ERK2结合的结构和能量稳定性。所鉴定肽的预测物理化学特性表明它们具有潜在的功能性。总体而言，这些计算机模拟结果提示肽41和49可能作为有前景的ERK2抑制剂，值得进一步实验验证。
引言
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族在调节多种生物过程中起着重要作用，包括细胞生长和分裂[1]、[2]。由于激酶的关键调节作用，它们被提议作为癌细胞的潜在生物标志物，激酶活性的失调与多种疾病密切相关，包括广泛的癌症[3]、[4]。MAPK家族主要分为三个亚家族：c-Jun N末端激酶（JNKs）、p38 MAP激酶和细胞外信号调节激酶（ERKs）[5]。其中，ERKs研究最为深入，包含两种异构体ERK1/2，它们是MAPK/ERK信号级联反应的主要组成部分[6]。ERK1/2可被多种上游刺激激活，如辐射、细胞因子、信息素和生长激素，并作为细胞分化和增殖等关键过程的调节因子[7]。具体而言，ERK2磷酸化并调节多种转录因子，包括c-Fos、p53和ELK1，从而调节与细胞增殖和癌症进展相关的基因表达程序[8]、[9]。结构上，ERK2包含四个基本位点：ATP结合位点、催化位点、激活环和D-招募位点（DRS）（图1）[10]、[11]。
传统的激酶抑制策略依赖于小分子抑制剂，通常是嘌呤衍生物，它们竞争性地结合到ATP结合位点，从而阻碍ATP的结合和酶活性[12]。尽管已经开发了许多ERK2抑制剂，但目前只有10种正在进行I期和/或II期临床研究[13]、[14]、[15]、[16]。一个值得注意的例子是BVD-523（Ulixertinib），这是一种可逆的、ATP竞争性ERK1/2抑制剂，目前正在I期和II期临床研究中用于治疗晚期胰腺癌、转移性葡萄膜黑色素瘤和非霍奇金淋巴瘤[13]。然而，由于多种激酶具有高度保守的ATP结合位点，这种策略通常存在高毒性、选择性有限和药物耐药性增加的问题。为了克服这些挑战，提出了替代方法，例如利用蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）而不是针对催化活性。在这种情况下，抑制激酶的DRS（在空间上与催化位点不同）已成为提高药物选择性的一个有吸引力的选择[17]。
治疗性肽因其高目标特异性和易于合理设计而受到越来越多的关注[18]、[19]、[20]、[21]。此外，治疗性肽在特定器官中的积累倾向较低，这进一步降低了潜在的毒性[22]、[23]、[24]。在众多生物活性肽来源中，牛奶是最受研究的之一，它是具有多种功能特性的生物活性肽的丰富来源[25]。牛奶来源的生物活性肽与较低的副作用风险相关，使其特别适合作为药物剂、膳食补充剂或功能性食品添加剂[25]。牛奶生物活性肽数据库（MBPDB）是关于牛奶来源肽的最全面资源，涵盖了广泛的物种、蛋白质和生物功能[25]、[26]。
短肽可以通过阻断PPI接口来选择性调节ERK2，避免高度保守的ATP结合口袋[27]、[28]。具体来说，源自ERK2调节因子D位点基序（也称为激酶相互作用基序KIMs）的肽与ERK2 DRS相互作用，从而竞争性地抑制底物结合和信号转导[29]。生化和结构分析表明，这些肽结合到ERK2的保守疏水/酸性对接槽中，并通过H键和与关键DRS残基的静电相互作用稳定[30]。这种基于肽的策略强调了通过其对接表面选择性调节ERK2信号传导的可行性，并确立了DRS作为可药物化的别构靶点。据我们所知，牛奶来源的生物活性肽或其他食品来源肽作为ERK2 DRS靶向剂的潜力尚未得到系统研究，表明本研究探索了一个之前未被充分研究的领域。
在本研究中，准备了包含108种具有已知抗癌和抗氧化活性的肽的MBPDB，并使用对接计算方法对其与ERK2 DRS的结合进行了筛选。随后，将排名靠前的肽用于分子动力学（MD）模拟，并使用分子力学广义Born表面积（MM-GBSA）方法评估结合能。之后，对鉴定出的肽进行了200 ns MD模拟后的分析。此外，还预测了这些肽的物理化学特性以检查其功能潜力。用于过滤MBPDB中与ERK2 DRS结合的计算技术的流程图显示在图2中。当前研究强调了鉴定出的牛奶来源肽作为有前景的ERK2抑制剂和潜在抗癌候选药物的潜力，值得进一步的体外/体内研究。
章节片段
ERK2的制备
本研究选择了与KIM肽（PDB条目：2FYS）结合的ERK2的3D结构作为结构模板[31]。应用建模软件构建了非末端残基[32]。省略了水分子、共结晶的肽和杂原子。使用PropKa程序指定了ERK2可滴定残基的质子化状态[33]。此外，还插入了所有缺失的氢原子。
MBPDB的筛选
从牛奶生物活性肽数据库中获得了总共944个条目。该数据集首先根据报道的生物活性进行了筛选，得到了108种具有抗癌和抗氧化特性的肽。随后根据序列长度（5-15个氨基酸）进行了进一步筛选，得到了66个肽（表S1，支持信息）。然后使用AlphaFold2软件对这些肽进行了建模。对于每个肽，选择了最稳定的预测构象
结论
ERK2通过磷酸化关键转录因子来调节细胞增殖和存活，其失调会导致异常信号传导，从而促进癌症进展。因此，选择性抑制ERK2信号传导已成为一种可行且有前景的治疗策略。治疗性肽具有高目标特异性和可调结构，使其成为有吸引力的抗癌剂。牛奶来源的生物活性肽特别值得关注，因为它们具有有利的
CRediT作者贡献声明
Mahmoud A. A. Ibrahim：撰写——原始草稿、软件、资源、项目管理、方法学、调查、正式分析、数据管理。Nahlah Makki Almansour：撰写——审阅与编辑、验证、软件、资源、项目管理、概念化
数据可用性声明
所有相关数据均包含在手稿及其支持信息文件中。
利益冲突声明
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致谢
作者感谢沙特阿拉伯教育部的研究与创新办公室通过项目编号0037-1446-S资助了这项研究工作。
