真皮成纤维细胞通过恢复滑膜成纤维细胞稳态减轻骨关节炎

《Journal of Orthopaedic Translation》：Dermal fibroblasts attenuate osteoarthritis by restoring synovial fibroblast homeostasis

　　

骨关节炎（OA)是全球范围内致残的主要原因之一，患者数量庞大，其中膝OA最为常见。除流行病学负担外，膝OA还导致患者进行性关节疼痛、活动受限、合并症风险增加，并带来沉重的社会经济负担。滑膜作为关节囊内表面的结缔组织，是OA进展的关键调控者，其生理状态下负责营养运输、废物清除和免疫调节，由组织驻留滑膜成纤维细胞等维持关节稳态；病理状态下，滑膜炎(synovitis)通过破坏这一平衡驱动OA恶化，表现为滑膜成纤维细胞增殖、巨噬细胞募集及最终的增生、肥大和纤维化，进而释放促炎细胞因子并增加滑膜血管通透性，加速膝OA进展。然而，现有抗炎治疗因未能逆转滑膜成纤维细胞的根本功能障碍而效果不佳。成纤维细胞现已被认定为慢性炎症性疾病的中心调控者，其致病性激活——以促炎和促纤维化表型为标志——在OA和类风湿关节炎(RA)中均得到广泛验证，确立了失调的成纤维细胞谱系作为关节炎的核心病理靶点。近期跨组织单细胞转录组研究进一步定义了哺乳动物组织中保守的"通用成纤维细胞"(universal fibroblast)群体，其标志基因表达与致病性激活呈强负相关，为通过靶向特定成纤维细胞亚群/谱系治疗慢性炎症性疾病提供了潜在策略。值得注意的是，关键性的静息态滑膜下层成纤维细胞亚群与未损伤真皮成纤维细胞(DFbs)及通用成纤维细胞具有显著的转录组相似性，且静脉注射DFbs已被证实可减轻自身免疫性关节炎。基于此，研究人员系统探究了关节内DFb注射在大鼠前交叉韧带切断(ACLT)OA模型中的治疗效力，并通过多组学分析和功能验证实验探索其潜在机制。

骨关节炎(OA)作为全球广泛流行的致残性疾病，其病理机制中滑膜炎症驱动的滑膜成纤维细胞谱系稳态破坏是核心环节，而已有抗炎治疗未能纠正这一根本性功能障碍，因此探索能够恢复滑膜成纤维细胞稳态的新型治疗策略具有重要临床意义。该研究发表于《Journal of Orthopaedic Translation》，由Lei Shi、Tong Xing、Kexin Liu等研究人员完成，旨在验证通过细胞治疗恢复滑膜成纤维细胞稳态以干预OA的可行性。

研究人员开展的研究主要包括以下方面：首先，通过公共数据库单细胞测序数据重新分析结合临床样本组织学检测，明确了膝OA滑膜中滑膜成纤维细胞谱系失调的特征，即滑膜下层(SL)成纤维细胞显著扩增并呈现促炎、衰老表型，同时发现DFbs与健康滑膜成纤维细胞在表型和转录组上具有高度相似性，且对炎症刺激具有内在抵抗性。其次，通过构建大鼠ACLT模型，采用关节内注射方式给予标记DFbs，利用活体生物发光成像追踪细胞在体滞留情况，并结合scRNA-seq解析细胞命运；同时设置8周观察期评估治疗效力，通过 gait 分析、组织病理学评分及micro-CT检测评价关节功能与结构改善情况。机制层面，采用Transwell共培养系统验证DFbs对滑膜成纤维细胞和软骨细胞的旁分泌调控作用，并通过数据非依赖性采集(DIA)定量蛋白质组学筛选关键效应分子，继而通过过表达和siRNA敲低进行功能验证。

研究关键技术与方法：研究使用了人类滑膜组织样本（健康供体3例，OA患者8例）及包皮组织来源的原代DFbs（健康供体3例），以及SD大鼠ACLT模型；技术手段包括synovial scRNA-seq数据挖掘（GSE216651、GSE327818数据集，Seurat分析）、大鼠滑膜scRNA-seq（dnbc4tools处理）、批量RNA测序、DIA定量蛋白质组学（Vanquish Neo UHPLC-Astral LC/MS）、活体生物发光成像（IVIS Spectrum）、多色免疫荧光、组织病理学评分（Krenn评分/OARSI标准）、micro-CT三维重建、CatWalk步态分析系统、CCK-8增殖检测、Annexin V/PI凋亡检测、Transwell共培养、RT-qPCR及Western blot等。样本队列来源为：健康滑膜取自因髌骨脱位或半月板损伤接受关节镜手术的年轻患者；OA滑膜取自因终末期膝OA行全膝关节置换术的患者；包皮组织取自传统包皮环切术患者。

研究结果部分按以下小标题展开：

慢性炎症与膝OA滑膜中滑膜成纤维细胞的衰老：通过对公共scRNA-seq数据集(GSE216651)的重新分析，研究人员发现OA滑膜中成纤维细胞谱系发生显著重塑，滑膜下层(SL)成纤维细胞相对健康对照显著扩增，表现出促炎和衰老相关转录本上调，KEGG和GSEA分析确认炎症信号、侵袭通路和衰老相关基因特征富集。临床样本验证显示OA滑膜出现滑膜下层增厚、细胞增多及多核细胞等病理改变，IL-6⁺和CXCL1⁺细胞比例显著升高，表明膝OA滑膜以病理性促炎、衰老SL成纤维细胞扩增为特征，破坏了谱系平衡。

DFbs重现了健康滑膜成纤维细胞的稳态表型和转录组：形态学观察显示OA滑膜成纤维细胞呈扁平、不规则的衰老形态，而健康滑膜成纤维细胞与DFbs均保持纺锤形静息态形态。批量RNA测序的Pearson相关性分析表明DFbs与健康滑膜成纤维细胞呈强正相关，而与OA滑膜成纤维细胞明显分离。"OA相关基因"交集分析显示DFb与健康滑膜成纤维细胞差异基因中仅约5%与OA病理相关，GSEA未发现DFbs相比健康滑膜成纤维细胞有显著炎症或OA相关通路上调，RT-qPCR验证IL6、CXCL1、CXCL3、BMP2等关键基因表达一致。据此，DFbs被认为能够忠实重现健康滑膜成纤维细胞的形态表型和稳态转录组特征。

DFbs相较于滑膜成纤维细胞对IL-1β刺激表现出钝化的增殖和炎症反应：CCK-8检测显示IL-1β刺激下滑膜成纤维细胞增殖时间依赖性显著增加，而DFbs增殖率不变；Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术显示两组细胞凋亡无显著差异。RT-qPCR表明DFbs对IL-1β的炎症反应明显钝化，Il6、Cxcl1、Nos2、Ptgs2的上调幅度显著弱于滑膜成纤维细胞，提示DFbs在炎症应激下具有表型稳定性。

DFbs在鼠滑膜中定植并持续存活：通过慢病毒稳定表达GdGreen和荧光素酶的DFbs，以及SD-CAG-EGFP转基因大鼠来源的DFbs进行在体追踪。活体生物发光成像显示荧光素酶信号在注射后超过3周仍可检测，初期下降平缓，第7-10天下降更明显；完整关节中DFbs滞留时间长于ACLT损伤关节。多色免疫荧光证实GFP⁺ DFbs定位于滑膜衬里层和衬下层，与Vimentin⁺滑膜组织共定位，而不与COL2A1⁺软骨共定位，显示其固有的滑膜趋向性。头部、腹部未检测到生物发光信号，主要脏器组织学及GFP免疫荧光正常，未发现脱靶定植，证实关节内递送的安全性。

关节内注射外源DFbs后的单细胞转录组学解析其体内命运和功能异质性：对大鼠ACLT关节注射GFP标记DFbs后5天的滑膜进行scRNA-seq，鉴定出7个主要细胞群体，成纤维细胞进一步分为8个转录异质性亚群，包括成纤维细胞祖细胞(FPCs)、Sfrp4⁺成纤维细胞、滑膜下层成纤维细胞(SL fibro)、滑膜衬里层成纤维细胞(LL fibro)及两个外源GFP⁺成纤维细胞亚群(Fib6、Fib7)。伪时间分析揭示从Fib8(FPC)出发的两条分化分支。DFb治疗组SL成纤维细胞比例较PBS组显著降低。GFP⁺ Fib6亚群富集缺氧、氧化应激和凋亡信号，凋亡基因特征评分显示外源DFb亚群凋亡活性高于多数内源滑膜成纤维细胞群体，但部分细胞保留Mki67高表达。细胞间通讯分析揭示外源DFbs与滑膜巨噬细胞之间存在广泛双向通讯，DFbs通过CSF和TGF-β信号调控巨噬细胞，巨噬细胞则主要通过TNF信号通路影响DFbs。

关节内注射DFbs改善典型病理步态表型和滑膜炎：ACLT术后2周关节内注射DFbs，8周时评估。体重监测显示ACLT+PBS组因疼痛导致活动减少而体重显著增加，DFb治疗组介于中间。CatWalk步态分析显示DFb治疗组患肢摆动速度、占空比等关键参数显著改善，提示运动功能恢复。组织病理学显示DFb治疗显著减轻滑膜增生、增厚和细胞浸润，降低滑膜炎评分；免疫荧光证实IL-6⁺促炎细胞比例减少。

关节内注射DFbs保护关节软骨结构和稳态：H&E和番红O-固绿(SO/FG)染色显示DFb治疗组蛋白多糖保留较好、软骨厚度丢失减轻，OARSI评分显著低于ACLT+PBS组。micro-CT三维重建显示DFb治疗组骨赘数量和大小减少，骨赘评分介于假手术组与ACLT+PBS组之间。免疫荧光显示MMP3⁺、MMP13⁺、iNOS⁺细胞比例降低，COL2A1⁺区域增大，表明软骨分解代谢减轻、合成代谢增强。

DFbs通过旁分泌改善滑膜成纤维细胞和软骨细胞的炎症表型：Transwell共培养系统验证，DFb共培养显著逆转IL-1β诱导的滑膜成纤维细胞促炎表型，炎症反应和细胞黏附相关通路下调，Il6、Cxcl1等表达降低，IL-6蛋白免疫荧光减弱。对软骨细胞而言，共培养后炎症基因(Ptgs2、Cxcl1、Nos2)显著下调，炎症反应和细胞外基质(ECM)相关基因富集分析显示逆转效应，Mmp9、Mmp13下调而Acan、Col2a1上调，阿尔新蓝染色显示IL-1β诱导的软骨形成障碍部分恢复。

DFbs旁分泌APOD抑制滑膜成纤维细胞炎症激活和软骨细胞分解表型：DIA定量蛋白质组学筛选DFbs条件培养基分泌蛋白，与OA滑膜成纤维细胞下调差异基因交集分析确定12个候选治疗蛋白，其中载脂蛋白D(APOD)在OA滑膜成纤维细胞中显著下调而在DFbs中高表达。功能验证显示，DFbs过表达APOD显著下调滑膜成纤维细胞促炎基因(Nos2、Il6、Ptgs2)和软骨细胞分解代谢基因(Mmp9、Mmp13)表达，而siRNA敲低APOD则显著削弱上述效应；Western blot在蛋白水平确认。重组APOD蛋白单独作用仅显示中等治疗效力，显著弱于空载体DFb共培养组，表明APOD是关键但非唯一的旁分泌介导因子，PDGFA、IGF2、IL1RN等其他因子可能协同发挥作用。大鼠滑膜组织免疫荧光显示DFb治疗显著减少COX2⁺细胞，进一步验证APOD的体内抗炎作用。

讨论部分总结：该研究提出并验证了一种基于恢复滑膜成纤维细胞谱系稳态的OA新型细胞治疗范式。研究人员指出，外源DFbs作为保留通用成纤维细胞核心转录特征的"功能性替代物"，能够重新平衡滑膜成纤维细胞池：通过抑制病理性滑膜下层成纤维细胞扩增并逆转其促炎激活，恢复谱系组成正常化和转录功能静息态两个核心维度。DFbs的内在抗炎性使其能够在OA关节微环境中维持稳态表型，这是其关键优势所在。治疗成功的关键在于靶向定植、持久生物活性和良好安全性，DFbs均满足：特异性定位于滑膜衬里层和衬下层，至少持续3周，且无脱靶迁移或器官毒性，支持" hit-and-run "作用机制——短暂定植的DFbs通过分泌生物活性因子重塑滑膜微环境，即使大多数移植细胞被清除后仍能产生持久疾病修饰效应。scRNA-seq解码了移植DFbs的体内命运，揭示其同时存在应激诱导凋亡和残留增殖，并与滑膜巨噬细胞存在双向通讯，放大了微环境重塑效应。机制上，蛋白质组学和功能验证确定APOD为DFb作用的关键旁分泌介质，但重组APOD不能完全复制完整DFbs的疗效，提示"分泌组鸡尾酒"中多因子的协同作用。该研究还为基于MSC的OA治疗提供了新视角：DFbs具有组织易获取性、谱系特异性和良好安全性，是MSC的务实替代或补充。研究局限性包括临床队列年龄性别分布不平衡、DFb治疗2个月以上长期耐久性未确定、未与MSC进行头对头比较、APOD下游信号通路尚待阐明。

研究结论部分翻译：综上所述，本研究提出了一种新型基于细胞的治疗策略：通过细胞治疗恢复滑膜成纤维细胞稳态，以打断OA中病理性滑膜-软骨相互作用。通过严格的体外和体内实验的经验性验证，证实了该方法的可行性。通过填补基于细胞治疗应对膝OA相关滑膜炎的关键空白，研究发现为早期至中期患者提供了一种新型治疗选择。该治疗范式有望延缓疾病进展并降低该患者群体接受膝关节置换术的必要性。