马钱素(Loganin)通过靶向TOP1MT(线粒体拓扑异构酶I)介导的肝细胞凋亡与铁死亡改善对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤

《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Loganin ameliorates acetaminophen-induced acute liver injury via targeting TOP1MT?mediated hepatocyte apoptosis and ferroptosis

　　

对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）过量可导致严重肝损伤，亟需开发新型治疗药物。本研究报道马钱素（Loganin，LOG）——源自药食同源植物山茱萸（Cornus officinalis）的活性成分——在APAP诱导的急性肝损伤（APAP-induced acute liver injury，AILI）小鼠模型中发挥肝脏保护作用。LOG降低脂质过氧化（lipid peroxidation，LPO）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成及铁超载，从而抑制AILI模型肝细胞的凋亡与铁死亡（ferroptosis）。上述结果经凋亡与铁死亡诱导剂验证，其效应可被LOG共处理逆转；联合应用凋亡及铁死亡抑制剂可增强LOG的作用。采用基于活性的蛋白质组分析可点击炔基标记LOG探针（LOG-probe，LOG-P），鉴定线粒体拓扑异构酶I（mitochondrial topoisomerase I，TOP1MT）为LOG的直接作用靶标。在H2O2诱导的氧化应激细胞模型中，TOP1MT缺失通过影响下游凋亡/铁死亡调节因子表达显著削弱LOG的效应。一致地，经腺相关病毒介导的TOP1MT短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低内源性肝TOP1MT后，LOG在AILI小鼠中的保护作用消失。因此，本研究为推进LOG在精准营养与医养食品中的应用奠定了基础。

论文解读：马钱素通过靶向TOP1MT介导的肝细胞凋亡与铁死亡改善对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤

研究背景与立题依据

对乙酰氨基酚（Acetaminophen，APAP）是全球最常用的解热镇痛药，常规剂量安全，但过量可致药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）甚至急性肝衰竭。APAP过量时代谢酶饱和，毒性代谢物N-乙酰-对-苯醌亚胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI）蓄积并耗竭谷胱甘肽（glutathione，GSH），引发线粒体氧化应激、功能障碍及肝细胞死亡。目前一线解毒药N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）治疗窗口窄且有一定不良反应。近年研究表明铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖性脂质过氧化累积导致的程序性细胞死亡）参与多种肝病，但其在AILI（APAP-induced acute liver injury）中的作用及能否作为治疗靶点尚不明确。马钱素（Loganin，LOG）是中药山茱萸的主要环烯醚萜苷类成分，具抗氧化、抗炎及抗凋亡活性，但其保肝分子机制未明。该研究由牛豆、余小波、杨悦、李燕、王萌、王继刚、薛茜昶及康杰芳（陕西师范大学）完成，发表于《Journal of Pharmaceutical Analysis》。

主要关键技术方法

研究人员首先建立C57BL/6小鼠APAP诱导急性肝损伤（AILI）模型及H₂O₂诱导HepG2细胞氧化应激模型；通过血清生化（ALT、AST、SOD、CAT、GSH）、H&E及TUNEL染色、透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）评估肝损伤、凋亡与铁死亡；采用基于活性的蛋白质组分析（activity-based proteome profiling，ABPP）结合点击化学及LC-MS/MS筛选LOG直接结合靶标；通过细胞热位移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）、等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）及免疫荧光共定位验证LOG与TOP1MT（mitochondrial topoisomerase I）的直接结合及亲和力；利用siRNA敲低HepG2细胞中TOP1MT，并以肝特异性AAV8-shTOP1MT敲低小鼠肝脏TOP1MT，验证靶标必要性；采用凋亡诱导剂（CHX）/抑制剂（ZVAD）及铁死亡诱导剂（erastin）/抑制剂（Fer-1）干预明确LOG通过抑制凋亡与铁死亡发挥保护；通过Co-IP检测LOG对TOP1MT泛素化降解的影响；Western blot检测Bax、Bcl-2、Nrf2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2）、SLC7A11（solute carrier family 7 member 11）、GPX4（glutathione peroxidase 4）等凋亡与铁死亡相关蛋白。

研究结果

3.1. LOG ameliorates AILI through inhibition of oxidative stress in vivo

研究人员在AILI小鼠模型中发现，LOG（80、160 mg/kg，灌胃10天）显著提高存活率，减轻体重下降幅度，降低肝组织病理评分及坏死程度，减少血清ALT、AST水平，恢复肝组织SOD、CAT活性及GSH含量，抑制CYP2E1（cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1）表达及ROS生成，表明LOG通过抑制氧化应激改善AILI。

3.2. LOG suppresses APAP-induced hepatocyte apoptosis and ferroptosis

APAP致小鼠肝细胞TUNEL阳性凋亡细胞增多，TEM显示典型铁死亡线粒体形态（线粒体皱缩、膜密度增加、嵴减少）；Western blot示APAP上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡Bcl-2，且下调抗氧化转录因子Nrf2及铁死亡负调控蛋白SLC7A11、GPX4。LOG处理逆转上述变化，证实LOG抑制APAP诱导的肝细胞凋亡与铁死亡。

3.3. LOG suppresses H₂O₂-induced hepatocyte apoptosis and ferroptosis

在H₂O₂诱导的HepG2氧化损伤模型中，LOG剂量依赖性地降低ROS、Fe²⁺/Fe³⁺及LPO水平，减少Annexin V⁺/PI⁺凋亡细胞比例，上调Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达，恢复线粒体膜电位及线粒体嵴结构（TEM），表明LOG在体外同样抑制氧化应激诱发的凋亡与铁死亡。

3.4. Induction of apoptosis and ferroptosis abolishes the hepatoprotective effect of LOG

凋亡诱导剂CHX抵消LOG对Bax/Bcl-2的调节作用及抗凋亡效果，凋亡抑制剂ZVAD增强之；铁死亡诱导剂erastin逆转LOG对Nrf2/SLC7A11/GPX4的上调及抗铁死亡作用，铁死亡抑制剂Fer-1与LOG效应相当且二者无叠加，说明LOG的保护依赖于抑制凋亡与铁死亡通路。

3.5. LOG directly targets TOP1MT

合成炔基标记LOG探针（LOG-P）进行ABPP pull-down及LC-MS/MS，从34个富集蛋白中锁定线粒体拓扑异构酶I（TOP1MT）为LOG直接靶标。LOG-P与LOG存在竞争性结合；免疫荧光显示LOG-P与TOP1MT共定位；Pull-down、CETSA及ITC（K_D=1.02±0.492×10^?3μM，n≈1）证实LOG与TOP1MT直接结合并使TOP1MT热稳定性增加；Co-IP显示LOG通过抑制泛素化介导的蛋白酶体降解稳定TOP1MT蛋白水平（MG-132可模拟此效应）。

3.6. TOP1MT deficiency exacerbates ferroptosis and apoptosis in H₂O₂-induced HepG2 oxidative stress model

siRNA敲低TOP1MT后，LOG无法再降低H₂O₂诱导的ROS、不能维持线粒体膜电位（JC-1染色）、不能抑制LPO及Fe²⁺/Fe³⁺蓄积；Bcl-2、Nrf2、SLC7A11、GPX4下调及Bax上调不被LOG逆转，TEM见典型铁死亡线粒体改变不受LOG挽救，证明LOG的保肝效应依赖于TOP1MT。

3.7. Knockdown of TOP1MT abolished the hepatoprotective efficacy of LOG and aggravates ferroptosis and apoptosis in AILI mice

尾静脉注射AAV8-TBG-shTOP1MT建立肝脏TOP1MT敲低小鼠，APAP造模后LOG无法再降低血清ALT/AST、无法恢复肝SOD/CAT/GSH、不能抑制CYP2E1及ROS，肝组织病理损伤、TUNEL阳性细胞及铁死亡线粒体形态不被LOG改善，凋亡/铁死亡相关蛋白变化亦不被LOG逆转，证实体内LOG通过靶向TOP1MT发挥AILI保护作用。

3.8. LOG exerted therapeutic effects on AILI in vivo

另设治疗性干预实验证实LOG可降低APAP中毒小鼠血清转氨酶、减轻肝组织坏死及铁死亡样线粒体损伤，进一步确认LOG对AILI的治疗潜力。

讨论与结论总结

讨论部分指出，LOG是山茱萸主要活性成分，本研究首次证实其通过直接结合并稳定TOP1MT、抑制其泛素化降解，上调Nrf2-SLC7A11-GPX4轴及调控Bcl-2/Bax，抑制肝细胞氧化应激、凋亡与铁死亡，改善AILI；肝脏特异性敲低TOP1MT消除LOG保护作用，确立TOP1MT为核心功能靶标；ABPP提示LOG可能存在其他辅助结合蛋白，作用具网络特征。研究局限包括TOP1MT在肝损伤中下调的具体E3连接酶未阐明、TOP1MT调控ROS及凋亡/铁死亡基因的详细转录机制待深究。

结论（翻译）：本研究表明马钱素（Loganin，LOG）通过靶向线粒体拓扑异构酶I（TOP1MT）有效防护对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤（AILI）。LOG降低肝细胞氧化应激、凋亡及铁死亡，改善肝功能并保存肝组织完整性。TOP1MT对LOG的肝保护作用至关重要，其敲低可使LOG疗效消失。这些发现提示LOG有望成为AILI的潜在治疗药物。