多重用药引发的亚致死性应激调控小鼠肝窦状内皮细胞的清除功能与窗孔结构

《The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics》：Sublethal stress from polypharmacy modulates scavenging function and fenestrations in mouse liver sinusoidal endothelial cells

　　

多重用药（polypharmacy）即同时使用多种药物，在老年人群中日益常见，并与跌倒、虚弱、功能与认知下降以及住院和死亡风险增加等不良结局相关。肝脏作为药物代谢的主要部位，在首过代谢（first-pass metabolism）、肝清除以及灌注过程中暴露于不同药物浓度，可能导致肝窦状内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSEC）的改变。LSEC是特化的内皮细胞，负责维持窗孔（fenestrations）——一种动态的跨细胞孔道，促进血液与肝实质之间的物质交换。窗孔受损可削弱肝功能，并促成多种肝脏疾病的发生。本研究考察了4种常用处方药——美托洛尔（metoprolol）、西酞普兰（citalopram）、奥昔布宁（oxybutynin）和羟考酮（oxycodone）——对LSEC功能的影响。研究人员分别在全身稳态浓度与首过浓度条件下，并以单药和多重用药混合方案模拟临床暴露，评估其对LSEC活力、内吞作用和窗孔形态的影响。所有处理均诱导了亚致死性代谢改变，但对LSEC功能的影响具有药物依赖性和浓度依赖性。西酞普兰和奥昔布宁引起剂量依赖性的去窗孔化（defenestration），而美托洛尔和羟考酮仅产生轻度且非剂量依赖性的效应。奥昔布宁、美托洛尔、羟考酮及多重用药混合方案可增强内吞活性，而西酞普兰无明显影响。多重用药混合方案在首过浓度下触发协同性去窗孔化，而在稳态水平下未见此现象。这些结果揭示了多重用药对LSEC的浓度依赖性与组合效应，强调在药物安全性与药代动力学评估中应考虑内皮反应，尤其是在暴露于多种药物的患者中。

该研究发表于《The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics》，聚焦多重用药（polypharmacy）对肝窦状内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSEC）的直接亚致死性影响。研究背景在于，多重用药在老龄化社会中愈发普遍，已被证实与药物不良反应、虚弱、功能衰退和死亡风险上升相关。肝脏是外源性化合物代谢与清除的核心器官，而LSEC位于肝血窦前线，具有高内吞活性和独特的窗孔（fenestrations）结构，承担血液与肝细胞间双向物质交换的重要职责。因此，口服药物在首过代谢阶段形成的高局部暴露，可能对LSEC造成功能和超微结构损伤。既往研究已提示老龄化、肝硬化、氧化应激（reactive oxygen species, ROS）及部分药物可影响LSEC窗孔，但常用临床药物尤其是在多重用药背景下，对LSEC清除功能与窗孔形态的直接、亚致死性影响仍缺乏系统表征。基于此，研究人员以青年成年小鼠来源LSEC为模型，试图排除年龄因素干扰，解析慢性多重用药可能触发的早期细胞事件，为理解肝脏内皮功能受损及其与药物安全性、药代动力学改变的关系提供机制线索。

研究人员选择西酞普兰、美托洛尔、奥昔布宁和羟考酮4种常用药物，并设置高药物负担指数（Drug Burden Index, DBI）多重用药混合方案，在体外模拟单药和联合用药情境，分别采用体内研究推导出的稳态浓度与首过浓度进行5 h暴露。研究发现，所有药物处理总体上均未造成明显细胞死亡，但可诱发代谢层面的亚致死性应激；其中首过浓度下的效应明显强于稳态浓度。功能方面，首过浓度的奥昔布宁、美托洛尔、羟考酮及联合用药可显著增强LSEC经清道夫受体（scavenger receptors）介导的内吞清除功能，而西酞普兰虽能显著改变窗孔结构，却不增强内吞。形态方面，所有处理在不同程度上降低LSEC孔隙率（porosity），而首过浓度更一致且更显著地降低窗孔频率（fenestration frequency）与孔隙率，提示去窗孔化加重。西酞普兰与奥昔布宁表现出更明显的浓度依赖性形态损伤；美托洛尔与羟考酮则主要表现为较轻的、非浓度依赖性影响。尤其值得注意的是，多重用药混合方案在稳态浓度下对窗孔形态影响有限，但在首过浓度下诱发协同性去窗孔化，说明药物联合作用在高局部暴露时可突破LSEC维持正常窗孔结构的能力。

从研究意义看，该文将多重用药的不良影响从传统的全身临床结局层面推进到肝脏微环境中的内皮细胞层面，提示即使在无明显细胞毒性的条件下，药物仍可重塑LSEC的清除功能与窗孔超微结构。这一发现为解释老年患者在多重用药状态下出现的药物代谢改变、肝功能脆弱性增加及系统性功能下降提供了新的细胞学依据，也强调在药物研发、药物安全性评价及药代动力学（pharmacokinetics, PK）评估中，不应仅关注肝细胞，还应重视肝窦内皮这一首当其冲的屏障和清除界面。

研究所用主要技术方法包括：从雄性C57BL/-/-6JRj小鼠原代分离LSEC，采用CD146免疫磁珠富集并进行体外培养；依据既往老龄小鼠体内实验测得的药物稳态血药浓度及口服生物利用度，换算单药与高DBI联合方案的稳态和首过暴露浓度；使用Resazurin/Resorufin检测细胞代谢活性与活力；以¹²⁵I-甲醛处理血清白蛋白（formaldehyde-treated serum albumin, FSA）清除实验定量评估LSEC内吞与降解能力；采用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察窗孔超微结构，并结合定制StarDist分割模型对窗孔频率、孔隙率及直径分布进行定量分析。全部实验至少包含3个生物学重复，总计使用30只小鼠。

在结果部分，论文首先给出“3.1. First-pass concentrations of drugs enhance LSEC scavenging function without affecting their viability”。该部分显示，无论单药还是多重用药混合方案，在稳态浓度下均未显著改变LSEC活力；首过浓度的单药总体也未显著降低活力，而首过浓度的联合用药反而提高了Resazurin还原信号，提示其更可能反映应激相关代谢增强，而非真正的活力提升。功能检测进一步表明，稳态浓度下各药物与联合方案对¹²⁵I-FSA摄取和降解均无显著影响；但在首过浓度下，除西酞普兰外，奥昔布宁、美托洛尔、羟考酮及联合方案均显著增强内吞清除，说明高局部药物暴露可在不导致细胞死亡的前提下促发LSEC功能性应答。

“3.2. Effects of mono- and polypharmacy treatments on LSEC morphology”系统分析了药物对LSEC窗孔超微结构的影响。研究人员以SEM结合形态计量学评估孔隙率和窗孔频率，并进一步分析窗孔直径分布。该部分说明，药物处理对LSEC的影响并非仅限于生存或内吞层面，而是深入改变了血窦内皮的结构基础。

在“3.2.1. Impact of steady-state-level drug exposure on LSEC porosity and fenestration frequency”中，研究人员发现稳态浓度下，各单药及联合方案在SEM上总体保留了窗孔排列，但定量结果显示所有处理均显著降低孔隙率；其中西酞普兰、奥昔布宁、美托洛尔和羟考酮作用较明显，而联合方案虽亦达统计学差异，但下降幅度最小。窗孔频率方面，西酞普兰、羟考酮及美托洛尔可显著降低该指标，而奥昔布宁与联合方案无显著变化。由此可见，稳态暴露已足以导致LSEC轻度去窗孔化，但不同药物影响模式并不一致，且联合用药在该浓度下并未表现出简单叠加效应。

在“3.2.2. Effects of first-pass concentrations on LSEC porosity and fenestration frequency”中，首过浓度暴露导致更明显的结构损伤。SEM可见所有处理组窗孔减少更为显著；定量分析证实，所有处理组孔隙率均显著下降，窗孔频率也均较对照明显降低。西酞普兰、奥昔布宁及联合用药的影响尤为突出，美托洛尔与羟考酮虽也降低窗孔频率和孔隙率，但程度相对较轻。该结果证明首过暴露阶段的高药物浓度是驱动LSEC去窗孔化的重要条件。

关于窗孔直径分布的分析，研究人员指出未见非常明确的药物特异性直径模式，但在首过浓度下，各处理均增加了大窗孔（>200 nm）比例，提示窗孔群板（sieve plates）发生早期结构重塑；稳态浓度下则普遍减少小窗孔（<100 nm）比例，而中等直径窗孔（100–200 nm）变化不大。这说明药物诱导的去窗孔化并非单纯“全部孔洞均一减少”，而可能包含不同尺度窗孔的选择性重构。

讨论部分围绕活力、内吞和形态三方面展开。首先，在活力层面，作者认为Resazurin信号增加并不等同于细胞健康改善，而可能代表线粒体代谢激活。结合文献，4种药物均与ROS升高相关，ROS可通过升高胞内Ca²⁺、激活钙依赖性脱氢酶并促进电子传递链活性，从而增强Resazurin还原。因而，首过浓度下联合用药引起的信号增强更可能代表一种亚致死性代谢应激反应。其次，在内吞层面，作者指出LSEC对FSA的摄取主要依赖stabilin-1/-2介导的网格蛋白介导内吞（clathrin-mediated endocytosis, CME）。首过浓度下部分药物增强内吞，可能与ROS-Ca²⁺-CaMKK-β-PKC-ζ-AMPK相关通路被激活有关；而西酞普兰虽改变窗孔，却不增强内吞，提示LSEC结构与功能改变可发生解耦。再次，在形态层面，作者认为西酞普兰和奥昔布宁在高浓度下诱导更明显的去窗孔化，而美托洛尔与羟考酮作用较轻。联合用药在高浓度下出现协同性去窗孔化，提示药物组合可共同汇聚于氧化应激、Ca²⁺信号和细胞骨架重塑等通路，破坏LSEC窗孔稳态。讨论还指出，LSEC去窗孔化可能削弱药物跨窦状隙向肝细胞的转运，进而影响首过清除，这一现象对理解老年个体药物代谢能力下降具有潜在意义。

论文同时强调其局限性：其一，研究聚焦于原代小鼠LSEC的整合性结构和功能应答，尚未结合转录组学或蛋白质组学深入解析分子机制；其二，体外模型不能完全再现体内肝微环境，尤其缺少肝细胞摄取、代谢转化及细胞间信号对内皮反应的调节；其三，小鼠与人LSEC在转运体表达、代谢能力和信号网络方面存在种属差异，因此结果更适合作为机制性证据，而非对人体生理的直接定量预测。

研究结论部分可译为：本研究表明，西酞普兰、奥昔布宁、美托洛尔和羟考酮等常用药物可依据暴露水平的不同，差异性调控LSEC的结构与功能。所有药物均可能诱导亚致死性改变，但其功能学和形态学效应并不相同。与稳态水平相比，西酞普兰和奥昔布宁在首过浓度下引起更显著的形态改变，而美托洛尔和羟考酮仅造成轻度窗孔丢失，且两种浓度间差异较小。相反，在模拟首过代谢暴露的高浓度条件下，除西酞普兰外，所有药物均增强内吞活性；西酞普兰虽在首过浓度下诱导去窗孔化，却不显著影响内吞，提示5-羟色胺相关细胞骨架重塑可在不激活内吞信号通路的情况下改变孔道结构。多重用药混合方案的效应突出显示了暴露水平的重要性：在稳态浓度下其对形态无显著影响，而在首过浓度下则触发协同性去窗孔化，超过LSEC维持正常窗孔结构的能力。能够增强内吞而不引起窗孔丢失的药物，可能维持LSEC清除功能；而导致窗孔丢失的药物或药物组合，如西酞普兰、奥昔布宁或高DBI多重用药混合方案，则可能损害微循环与大分子清除。总体而言，这些结果强调了多重用药中亚致死性内皮应答的生理学重要性、药物效应的浓度依赖性，以及在药物安全性与药代动力学评估中关注肝脏内皮健康的必要性。