中性香草醛衍生物聚亚胺对金黄色葡萄球菌的蓝光抗菌作用得到增强

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Enhanced blue-light antibacterial action of a neutral vanillin-derived polyimine against Staphylococcus aureus

　　

马里莱娜·马里诺（Marilena Marino）|埃莉萨贝塔·戈维尔（Elisabetta Gover）|阿莎·布罗韦达尼（Asja Brovedani）|罗伯特·C·普拉尔（Robert C. Pullar）|达尼埃莱·戈伊（Daniele Goi）|弗朗切斯科·安德烈亚塔（Francesco Andreatta）|阿尔弗雷多·龙迪内拉（Alfredo Rondinella）|保罗·斯特拉佐利尼（Paolo Strazzolini）|克拉拉·科穆齐（Clara Comuzzi）

意大利乌迪内大学农业食品环境与动物科学系，Via delle Scienze 206，33100乌迪内

摘要

微生物污染在水和生物医学领域仍然是一个关键问题，这促使人们寻找能够减少化学物质使用和能源需求的可持续消毒策略。蓝光（400–470纳米）可以通过内源性卟啉的光激活和活性氧（ROS）的生成来使细菌失活；然而，通常需要较高的光强（>100焦耳/平方厘米）才能产生显著的抗菌效果，尤其是在470纳米这样的较长波长下，这限制了其实际应用。因此，开发出不需要外加光敏剂的降低所需剂量的策略是非常有必要的。在这里，我们研究了先前报道过的香草醛衍生的聚亚胺（VP）作为光惰性界面调节剂，以增强细菌对蓝光的敏感性。尽管VP本身不是光敏剂，但它可以通过诱导亚致死性应激来增强对金黄色葡萄球菌的蓝光抗菌效果，从而增加细菌对内源性光氧化途径的敏感性。单独使用VP薄膜在黑暗条件下培养90分钟后并未降低细菌的存活率，但菌落形态、生长动力学和扫描电子显微镜观察显示出现了亚致死性细胞应激。当VP薄膜与470纳米的光照结合使用（光强为18–54焦耳/平方厘米）时，显示出依赖于重复使用的抗菌活性增强效果：初次使用时效果有限，但随着重复使用，杀菌效果逐渐增强，最终达到了2个对数的降低。结构分析（BET/BJH）表明，重复使用导致的微裂纹增加了比表面积（原始薄膜为12.9平方米/克，重复使用后为21.8平方米/克），同时没有改变孔径分布，从而增强了聚合物与细胞之间的相互作用。重要的是，在测试条件下未检测到聚合物产生单线态氧、自由基或过氧化氢，表明抗菌活性来源于聚合物对细菌内源性光氧化途径的敏化。

引言

微生物污染在水处理、食品和生物医学领域是一个持续存在的挑战，这突显了需要高效、无毒且环境可持续的消毒策略。传统方法如氯化、热处理或化学杀菌剂虽然效果显著，但往往存在缺点，包括化学残留物、能源消耗以及促进耐药菌株的风险[1]。因此，人们越来越关注能够实现可靠微生物控制且符合可持续性标准的物理非热方法[2]。

基于光的抗菌策略受到了越来越多的关注。UV-C辐射（200–280纳米）因其通过直接破坏核酸而具有杀菌作用而广为人知，目前被用于水、空气和表面的消毒[3]、[4]。然而，其较差的穿透性、潜在的毒性以及安全管理风险限制了其更广泛的应用[5]、[6]。这些限制在水系统中尤为明显，因为光的穿透性是一个关键的实际参数。因此，人们开始关注可见光。特别是蓝光（400–470纳米）可以通过激发细菌内的色素（主要是卟啉和黄素）来使细菌失活，从而产生细胞内的ROS，进而损害膜、蛋白质和DNA[7]、[8]。在金黄色葡萄球菌中，这些内源性光敏剂主要是细胞内的卟啉，主要是Coproporphyrin III和Protoporphyrin IX，它们是血红素生物合成途径的中间产物，可作为有效的蓝光吸收剂[9]。在405–470纳米的激发下，它们会产生单线态氧和其他ROS，为蓝光敏感性提供了明确的机制[10]、[11]。

与UV-C不同，蓝光通常被认为对人体安全，并且与许多材料表面相容。然而，其抗菌效果强烈依赖于照射参数：通常需要接近420–450纳米的波长和超过100焦耳/平方厘米的光强才能实现细菌存活率的显著降低，而在较长波长（例如470纳米）下，效果明显减弱[12]、[13]、[14]。最近的研究表明，当以约108–400焦耳/平方厘米的光强照射金黄色葡萄球菌时，这种波长是有效的[15]。为了克服这一限制，人们经常使用外加光敏剂或色素材料来增强可见光下的ROS生成[16]、[17]、[18]。尽管这些方法有效，但它们带来了成本、光稳定性和潜在毒理学问题的额外限制。这些限制促使人们寻找无需依赖外部光敏剂的协同方法，理想情况下是通过调节细菌生理机制来增强蓝光的抗菌效果。

来自基于表面的系统的证据表明，材料性质可以调节细菌对光诱导的氧化应激的敏感性。例如，银纳米颗粒涂层与蓝光结合使用时表现出显著增强的抗菌效果[19]，而响应可见光的TiO?/g-C?N?纳米管层在原本杀菌效果较弱的照射条件下也能改善微生物的灭活效果[20]。这些研究，以及关于光活性抗菌涂层和光响应表面的最新工作，表明材料的界面或结构特征可以放大光驱动的抗菌效果，即使基质本身不是ROS的主要来源[19]、[20]。

基于聚亚胺的材料最近成为一类有趣的抗菌聚合物。多项研究表明，由芳香醛或酚类构建块衍生的聚亚胺可以抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长。然而，它们的活性通常较弱且高度依赖于接触，因为含有亚胺的网络被认为会引起亚致死性生理应激而不是快速的杀菌效果[21]、[22]。同时，先前的研究表明，处于亚致死性应激条件下的细菌细胞可能对蓝光/紫光的杀菌作用更加敏感[23]。基于此，我们假设聚亚胺引起的接触依赖性亚致死性应激可以类似地使细菌细胞对蓝光照射更加敏感，从而通过改变细胞应激反应来增强可见光处理的抗菌效果。ValPol（VP）是一种我们实验室最近开发的香草醛衍生的聚亚胺[24]，提供了一个合适的模型系统来探索这一假设。VP最初被引入作为固定光敏剂的惰性支架，现在用于测试另一种可能性：一种中性的、光惰性的聚亚胺是否可以通过接触依赖性的亚致死性应激来预处理细菌细胞，从而增加其对470纳米光照的敏感性。重要的是，本研究的新颖之处不在于合成了一种新的聚合物，而在于证明了这种先前报道的材料可以在蓝光下作为接触依赖性的生理敏化剂。此外，由于VP是一种可重复使用的动态网络，其表面可访问性在重复使用过程中可能会发生变化（例如通过微裂纹），从而可能增强聚合物与细胞之间的相互作用并放大预处理效果。因此，本研究的目标是（i）量化VP在黑暗条件下引起的亚致死性应激，（ii）确定这种预处理是否能够在中等470纳米光强（18–54焦耳/平方厘米）下显著增强抗菌效果（在没有VP的情况下效果较弱），从而确定聚合物介导的预处理作用的贡献，以及（iii）将重复使用依赖的性能变化与薄膜的结构演变联系起来。

部分摘录

化学物质和培养基

所有使用的化学物质均为市售产品（Sigma-Aldrich Italia S.r.l., 米兰, 意大利），除非另有说明，否则按原样使用。无水K₂CO₃是通过将商业粉末细磨并在250℃下处理8小时制备的。无水乙烷-1,2-二胺是通过在惰性气氛（Ar）下蒸馏商业试剂并收集后，用4埃分子筛在300℃下处理8小时获得的。无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）也是从...

为了研究VP薄膜是否具有内在的抗菌活性，将金黄色葡萄球菌悬浮液与VP在黑暗中共同培养90分钟。图1显示，整个培养过程中细菌存活率接近初始值。这不仅在未经处理的对照组中观察到，在VP薄膜使用的第一、第二和第三次使用时也同样观察到。特别是，没有检测到CFU随时间的减少，也没有发现抗菌效果的减弱

本研究并没有引入新的聚合物化学物质，而是展示了先前报道的香草醛衍生的聚亚胺VP的新功能作用。具体来说，即使聚合物本身没有内在的光活性，聚合物与细胞之间的相互作用也能显著影响可见光下的抗菌效果。在VP的情况下，与聚合物基质的接触会诱导出可重复的亚致死性应激，从而改变细菌对后续氧化挑战的反应。

马里莱娜·马里诺（Marilena Marino）：验证、监督、资源提供、方法学设计、数据管理、概念化、撰写——审阅与编辑、初稿撰写。埃莉萨贝塔·戈维尔（Elisabetta Gover）：方法学设计、实验研究、数据分析、撰写——审阅与编辑、初稿撰写。阿莎·布罗韦达尼（Asja Brovedani）：实验研究、数据分析、数据管理、撰写——审阅与编辑、初稿撰写。罗伯特·C·普拉尔（Robert C. Pullar）：验证、监督、方法学设计、实验研究、数据分析、

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作者声明没有利益冲突。