卟啉介导的红细胞光溶血机制

《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Mechanisms of porphyrin-mediated photohemolysis of erythrocytes

　　

莱斯·阿隆索（Lais Alonso）|尤里·E·博里谢维奇（Iouri E. Borissevitch）|法比奥·卡斯特罗·贝泽拉（Fabio Castro Bezerra）|安东尼奥·阿隆索（Antonio Alonso）|帕布罗·J·贡萨维斯（Pablo J. Gon?alves）

巴西戈亚斯联邦大学物理研究所，戈亚尼亚

摘要

本研究通过监测血红蛋白的释放和丙二醛（MDA）的生成，利用卟啉光敏剂（阴离子型5,10,15,20-四(4-磺酸苯基)卟啉（TPPS₄）、阳离子型5,10,15,20-四(1-甲基吡啶基-4-基)卟啉（TMPyP）及其相应的锌（II）配合物（ZnTPPS?和ZnTMPyP）介导的红细胞光诱导溶血现象进行了光谱分析。使用红细胞“幽灵”（EG）作为模型来评估光溶血过程，结果表明该过程是由于红细胞膜因脂质过氧化而发生光分解所致。卟啉的光溶血效率顺序为TPPS₄ ZnTPPS₄ TMPyP ZnTMPyP，这一顺序与荧光光谱法测得的卟啉对红细胞膜的亲和力一致。通过EPR自旋捕获方法发现，EG的脂质过氧化既通过活性氧（ROS）（I型机制）的产生，也通过单线态氧（II型机制）的发生；需要注意的是，检测到的ROS主要来源于周围溶液，而不仅仅是膜界面，尽管它们都对膜脂质过氧化有贡献。ZnTMPyP的最高光动力活性既源于其对EG膜的最高亲和力，也源于其激发三重态形成的最高量子产率，这使其能够高效地产生单线态氧和活性氧。

引言

可见光对生物体的影响是众所周知的。在许多情况下，如视觉和光合作用，这些影响基于光敏化反应，这些反应会导致生物系统的结构变化。然而，在某些病理条件下，例如红细胞生成性原卟啉病，这些反应可能导致生物结构的破坏[1]、[2]、[3]、[4]。这是由于红细胞中积累的原卟啉吸收光后引发的一系列过程所致，导致受影响个体出现急性且疼痛的光敏感症状。

另一方面，光敏化反应是光动力疗法（PDT）的基础，这是一种非侵入性的治疗方法，用于治疗包括癌症和微生物在内的多种疾病，该技术在过去几十年中得到了发展[3]、[4]、[5]、[6]。PDT包括将光敏剂（PS）注入患者体内，随后在所谓的“光治疗窗口”（600 nm < λ < 800 nm）内用光照射[4]。当PS吸收光子后，会被激发到单线态，随后发生系间跃迁到三重态。在这些状态下，PS分子可以通过涉及分子氧的电子转移反应与细胞结构相互作用，从而产生活性氧（ROS），如超氧阴离子自由基O?•^?、过氧化氢（H?O?）、羟基自由基（•OH）和其他自由基中间体（I型机制）。或者，三重态PS可以直接将其能量传递给分子氧，生成单线态氧（¹O?）（II型机制）[3]、[4]。这些ROS会与各种生物靶标反应，导致结构损伤，最终导致细胞死亡[3]、[4]。ROS的主要靶标包括蛋白质、核酸和细胞膜[7]、[8]、[9]、[10]。最近，还提出了一种不依赖氧的途径，通常称为III型机制，在这种机制中，激发的光敏剂可以直接与生物分子靶标相互作用，而不需要分子氧的参与，这为缺氧条件下的光动力作用提供了一种有前景的策略[11]、[12]。

光敏剂（PS）通常通过静脉注射进入体内，并通过血液运输到达靶组织。然而，在这一过程中，它们不可避免地会与多种血液成分发生相互作用。近年来，人们越来越关注使用PDT进行血液消毒，多项研究证明了其有效性[13]、[14]、[15]。最近，这种方法也被提出用于通过PS和光的联合作用来灭活SARS-CoV-2[16]、[17]、[18]。虽然这些发展突显了PDT的多功能性和治疗潜力，但也引发了关于非特异性光动力效应的重要问题。在血液中，PS可能会与红细胞、血浆蛋白和核酸结合，在光照下可能在这些生物系统中引发光敏化反应[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。这些过程可能导致结构损伤和功能障碍，从而影响重要的生理功能。因此，更清楚地了解这些相互作用对于确保在不损害全身安全性的前提下实现治疗效果至关重要。

红细胞（RBCs）是血液的关键组成部分，负责在体内结合和运输分子氧[24]。它们的损伤或破坏可能会产生严重的临床后果，这突显了在循环条件下评估光敏剂安全性的重要性，并补充了在核细胞中进行的研究。溶血可能导致一系列不良后果，包括严重贫血[25]、急性肾衰竭[26]、黄疸和高胆红素血症[27]、溶血相关性肾病[28]、深色尿液[29]、腹痛[30]、心源性休克[31]以及血栓形成风险增加[32]等。因此，研究光敏剂对红细胞的影响具有重要意义。

在这种情况下，去除了细胞内物质的红细胞（称为“红细胞幽灵”EG）可以用作研究膜特性的简化模型[33]。关于光敏剂对红细胞膜影响的研究可以为PDT过程中光敏剂的作用提供宝贵的见解。

在各种光敏剂中，卟啉是一类广泛用于光动力疗法（PDT）的化合物[34]、[35]。在本研究中，选择了四种卟啉作为PS模型：阴离子型5,10,15,20-四(4-磺酸苯基)卟啉（TPPS₄）、阳离子型5,10,15,20-四(1-甲基吡啶基-4-基)卟啉（TMPyP）及其相应的锌（II）配合物ZnTPPS₄和ZnTMPyP。选择这些结构相关且特征明确的卟啉是因为它们的光物理性质已被广泛研究[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]，这有助于更清楚地评估结构变化对其光敏化效率的影响。此外，它们与生物大分子[21]、[41]以及纳米结构系统（如量子点和纳米颗粒[42]、[43]、[44]）的相互作用进一步强调了它们在生物医学应用中的相关性和多功能性。

章节片段

光敏剂

本研究中使用的阴离子卟啉是5,10,15,20-四(4-磺酸苯基)卟啉四钠盐十二水合物（TPPS?）及其锌（II）配合物锌（II）5,10,15,20-四(4-磺酸苯基)卟啉钠盐（ZnTPPS?）。阳离子卟啉是5,10,15,20-四(1-甲基吡啶基-4-基)卟啉四磺酸盐（TMPyP）及其锌（II）类似物锌（II）5,10,15,20-四(1-甲基吡啶基-4-基)卟啉四磺酸盐（ZnTMPyP）。这些化合物是从

卟啉与EG的结合

将卟啉加入EG悬浮液会降低EG的荧光强度。图1(A)以TMPyP为例说明了这种猝灭效应。所有卟啉的Stern-Volmer图示见图1(B)，相应的Stern-Volmer常数（K_SV）列在表1中。

荧光猝灭可以通过动态或静态机制发生。在动态情况下，猝灭是由于荧光团（EG）与猝灭剂（卟啉）的碰撞引起的

结论

本研究表明，在卟啉作为光敏剂存在的情况下，用可见光照射红细胞悬浮液会诱导红细胞光溶血。这一过程是由于卟啉介导的红细胞膜光氧化，该过程通过I型和II型光动力机制进行，其中单线态氧起主导作用。活性氧（ROS）也有所贡献，这一点在存在清除剂（如钠）的情况下得到了部分证实

CRediT作者贡献声明

莱斯·阿隆索（Lais Alonso）：验证、方法学、研究、数据分析、概念化、撰写——初稿。尤里·E·博里谢维奇（Iouri E. Borissevitch）：验证、资源获取、方法学、研究、资金筹集、数据分析、撰写——审阅与编辑。法比奥·卡斯特罗·贝泽拉（Fabio Castro Bezerra）：验证、方法学、研究、数据分析。安东尼奥·阿隆索（Antonio Alonso）：验证、监督、资源获取、方法学、研究、数据分析

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了巴西研究资助机构国家科学技术发展委员会（CNPq）（资助编号：304468/2022-3、303764/2021-0、406572/2025-9和305533/2025-8）以及国家健康科学创新技术研究所（INCT PICS）（由巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）资助，资助编号：408417/2024-2）的财政支持。