纳米α-磷酸三钙的表征：凝固时间、抗菌活性及其对成纤维细胞的细胞毒性

《Journal of Taibah University Medical Sciences》：Characterization of nano α-TCP: Setting time, antibacterial activity and cytotoxicity on fibroblast cells

　　

背景

纳米α-磷酸三钙（nano α-TCP）因其可释放钙/磷酸根离子、具有抗菌特性及良好生物相容性，而被认为是一种潜在的盖髓材料。

目的

评价纳米α-磷酸三钙（nano α-TCP）的凝固时间、对变异链球菌（Streptococcus mutans）的抗菌活性以及其细胞毒性。

方法

采用Vicat试验测定凝固时间。采用直接接触试验评价100%、50%和25%浓度下的抗菌活性。采用细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）法，在24 h和72 h后评价其对成纤维细胞的细胞毒性。

结果

100%浓度的纳米α-磷酸三钙（nano α-TCP）表现出最强的抗菌效应和最快的凝固速度。所有测试浓度均维持较高的成纤维细胞存活率，提示其细胞毒性较低。

结论

纳米α-磷酸三钙（nano α-TCP）能够有效抑制变异链球菌（S. mutans），凝固迅速，并具有良好的生物相容性，支持其作为盖髓材料的潜在应用。

本文发表于《Journal of Taibah University Medical Sciences》，围绕纳米α-磷酸三钙（nano α-TCP）作为直接盖髓材料的应用潜力开展了系统的体外研究。研究背景在于，龋病仍是全球最常见的口腔疾病之一，其本质是细菌代谢产酸导致牙体硬组织脱矿，并可进一步累及牙本质和牙髓，最终引发牙髓炎症、感染甚至坏死。在此过程中，维持牙髓活力具有重要临床意义。直接盖髓术是保存牙髓活力的关键治疗手段，其核心在于将生物活性材料直接覆盖于暴露牙髓表面，以诱导修复性牙本质形成。因此，理想的盖髓材料应兼具良好的生物相容性、抗菌性能、成牙本质诱导潜能以及尺寸稳定性。

目前临床常用的直接盖髓材料主要包括氢氧化钙[Ca(OH)₂]和矿物三氧化物凝聚体（mineral trioxide aggregate, MTA）。Ca(OH)₂可通过释放氢氧根离子升高局部pH值，长期以来被视为标准材料；MTA则因其优良的生物相容性和促进牙髓组织再生的能力而受到广泛认可。然而，这两类材料仍存在明显局限：Ca(OH)₂在潮湿环境中的操作性能较差且凝固时间较长，MTA同样存在凝固时间偏长且成本较高的问题。基于此，纳米α-磷酸三钙（nano α-TCP）作为一种新型生物活性替代材料受到关注。α-TCP属于磷酸钙材料，具有促进硬组织形成的潜力；当其纳米化后，由于比表面积增大，其化学反应活性增强，与水性溶液接触后可更快发生水化反应，并释放钙离子（Ca²⁺）和磷酸根离子（PO₄^3?），从而促进羟基磷灰石形成、提高局部pH值并抑制细菌生长。同时，纳米尺度还可能改善凝固性能和材料力学特征。不过，此前研究在凝固动力学一致性、抗菌评价完整性以及纳米制剂细胞毒性证据方面仍存在不足，因此本研究具有明确的现实意义。

研究人员采用体外实验、仅设终点检测的对照组设计，对nano α-TCP的三个关键特性进行评价，即凝固时间、对变异链球菌（Streptococcus mutans）的抗菌活性以及对成纤维细胞的细胞毒性。研究结论表明，较高浓度的nano α-TCP具有更快的凝固速度和更强的抗菌作用；在25–100 μg/mL范围内，nano α-TCP对成纤维细胞未表现出细胞毒性，并支持细胞代谢活性/细胞数量增加。整体结果支持nano α-TCP作为直接盖髓生物活性材料的应用前景，但研究同时指出，尚未确定一种能够同时兼顾最佳抗菌效能、最快凝固表现与最高生物安全性的统一最优浓度。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究于印度尼西亚Universitas Trisakti牙科材料与测试中心及YARSI University综合研究实验室完成。研究人员以碳酸钙（CaCO₃）和无水磷酸氢钙（CaHPO₄）为前驱体，通过高能球磨法合成平均粒径为78.9 nm的nano α-TCP；采用Vicat仪测定不同浓度浆体的终凝时间；采用直接接触试验评价材料对变异链球菌ATCC 25175的抑菌作用，并以菌落形成单位（CFU/mL）计数；采用CCK-8法检测25、50、100 μg/mL nano α-TCP作用24 h和72 h后成纤维细胞的细胞代谢活性，并结合统计学方法分析组间差异。

在研究结果部分，论文首先报告了“Setting time of nano α-TCP”的结果。研究显示，不同处理组之间凝固时间存在显著差异。100% nano α-TCP的平均凝固时间最短，为60.33 ± 2.52 min；50%和25% nano α-TCP分别为75.33 ± 3.12 min和85.33 ± 4.05 min。对照材料中，MTA为71.00 ± 2.80 min，Ca(OH)₂为63.33 ± 2.45 min。该结果表明，随着nano α-TCP浓度升高，其水化反应加快，终凝时间缩短。研究人员据此认为，纳米级磷酸钙较大的比表面积和更高表面能促进了溶解-沉淀过程，并推动α-TCP向缺钙羟基磷灰石转化，进而加速材料硬化。尽管100% nano α-TCP较MTA具有约11 min的凝固时间优势，但论文也指出，这一差异的临床意义仍需进一步验证，因为两者仍属于相对较长的凝固时间范围。

在“Aantibacterial activity”部分，研究人员通过直接接触法比较了不同浓度nano α-TCP及对照材料对变异链球菌的抑制作用。结果显示，100% nano α-TCP、MTA和Ca(OH)₂组均未观察到细菌生长，菌落计数为0；50% nano α-TCP组菌落数为3075 × 10⁵ CFU/mL，25% nano α-TCP组为22,100 × 10⁵ CFU/mL，而蒸馏水阴性对照组细菌生长最高，为49,875 × 10⁵ CFU/mL。该结果表明，nano α-TCP的抗菌作用具有浓度依赖性，浓度越高，抑菌效果越强。研究人员在讨论中指出，其潜在机制可能与材料水化和降解过程中释放Ca²⁺和PO₄^3?、升高局部pH值有关，高碱性环境可破坏细菌细胞膜、使蛋白质变性并干扰酶活性。此外，纳米颗粒较大的表面积也可能增强与细菌细胞的直接接触，从而抑制细菌黏附和增殖。不过，论文同时明确说明，本研究并未直接测定离子释放动力学及pH变化，因此相关机制解释仍停留在推论层面，尚待后续定量研究证实。

在“Cytotoxicity and biocompatibility”部分，研究人员采用CCK-8法评价nano α-TCP对成纤维细胞的影响。24 h时，阴性对照组细胞数为30,192 ± 1846.17；100、50、25 μg/mL nano α-TCP组分别为35,636 ± 396.59、34,608 ± 668.72和32,652 ± 1752.36；MTA组为32,534 ± 1819.14，Ca(OH)₂组为33,635 ± 1316.21。72 h时，阴性对照组细胞数为50,178 ± 1221.79；100、50、25 μg/mL nano α-TCP组分别升至60,012 ± 2148.68、57,254 ± 1938.81和54,825 ± 906.73；MTA组为61,287 ± 1225.80，Ca(OH)₂组为51,812 ± 3225.87。结果提示，与阴性对照相比，nano α-TCP在所有测试浓度下于24 h和72 h均未表现细胞毒性，且支持成纤维细胞活性维持。研究人员据此认为，nano α-TCP具有良好的生物相容性，这可能与其化学组成接近天然骨矿物、并可释放有利于细胞信号调节和组织修复的生物活性离子有关。论文同时特别强调，CCK-8检测反映的是细胞代谢活性而非绝对细胞数量，因此相关结果应理解为存活细胞代谢增强的表现，而不能被过度解释为直接的细胞增殖证据。

在“Relationship between properties”部分，论文进一步对三类指标之间的关系进行了谨慎说明。研究人员指出，凝固时间与抗菌实验采用的是整体材料浓度（100%、50%、25%），而细胞毒性实验采用的是显著更低的浓度范围（25–100 μg/mL），因此不能据此得出某一单一浓度同时实现最佳凝固、最佳抗菌和最佳生物相容性的结论。这一点构成了本研究设计上的重要限制，也说明后续研究有必要建立临床相关浓度模型，以综合优化材料性能。

在“Study limitations and future perspectives”部分，研究人员总结了本研究的局限性。首先，对nano α-TCP的理化表征仅限于粒径分析，尚缺乏形貌、物相组成、结晶度及比表面积等更全面证据，未来需结合扫描电子显微镜、透射电子显微镜、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱和Brunauer–Emmett–Teller分析等技术进一步确认。其次，本研究未直接检测离子释放动力学及pH变化，因此抗菌机制尚未得到实验性验证。再次，全部生物学评价均在体外完成，不能完全模拟牙髓复杂微环境，仍需体内研究加以验证。除此之外，细胞毒性评价仅基于成纤维细胞，尚不能充分代表成牙本质细胞样细胞或牙髓干细胞的反应；抗菌实验仅针对单一菌种，也不足以代表临床多菌种感染状态；材料的封闭性、机械强度、溶解性及长期稳定性等关键功能指标亦未纳入考察范围。

综合全文，研究表明nano α-TCP作为直接盖髓候选材料具备较有前景的基础性能。较高浓度的nano α-TCP可获得更快的凝固时间及更强的抗变异链球菌活性，而在25–100 μg/mL范围内，对成纤维细胞未见细胞毒作用并表现出良好的细胞相容性。这些发现为其作为修复性牙科生物活性材料的进一步开发提供了初步依据。

结论部分可译为：纳米α-磷酸三钙（nano α-TCP）表现出作为直接盖髓应用潜在生物活性材料的良好特征。较高浓度可获得更快的凝固时间，并增强对变异链球菌（Streptococcus mutans）的抗菌活性。此外，nano α-TCP具有良好的生物相容性，所有测试浓度（25–100 μg/mL）均未表现出细胞毒性，并支持成纤维细胞增殖。然而，本研究尚未确定一种可同时最大化抗菌效能、凝固性能和生物安全性的单一最优浓度。因此，较高浓度在理化性质和抗菌性能方面显示出优势，但仍需进一步研究以确定最佳治疗浓度范围，并评价其长期生物学反应。