miR-148a-3p在多囊卵巢综合征（PCOS）患者血清中升高并通过调控ALDH1A3–视黄酸（Retinoic Acid, RA）信号通路降低颗粒细胞样细胞中雌激素的合成

《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：miR-148a-3p Is Elevated in Serum of PCOS Women and Modulates ALDH1A3–Retinoic Acid Signaling to Reduce Estrogen Synthesis in Granulosa-Like Cells

　　

摘要：多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome, PCOS）是一种具有显著生殖与代谢后果的异质性内分泌疾病，其分子机制尚未完全阐明。本研究探讨循环microRNA（miRNA）作为卵巢类固醇生成潜在调节因子在PCOS病理生理中的作用。研究人员采用病例对照设计，收集42例土耳其非糖尿病PCOS女性患者与42例年龄匹配健康对照者的血清样本，整合small RNA测序与基于类固醇特征的亚组分析。采用miRNA mimics在肾上腺及卵巢细胞模型（包括HGL5、OVCAR-3及KGN颗粒细胞）中检测差异表达miRNA的转录效应及体外雌二醇（Estradiol, E2）合成水平。血清谱分析鉴定miR-148a-3p在高雄激素PCOS患者中显著上调。功能实验显示miR-148a-3p增强乙醛脱氢酶1A家族成员3（Aldehyde Dehydrogenase 1 Family Member A3, ALDH1A3）的表达，促进视黄酸（Retinoic Acid, RA）合成并抑制颗粒细胞中E2的产生。荧光素酶报告实验证实miR-148a-3p可转录激活ALDH1A3。上述结果提示miR-148a-3p可能是PCOS中卵巢类固醇生成的调节因子。通过驱动ALDH1A3介导的RA生成并降低雌激素合成，miR-148a-3p可能参与高雄激素表型的形成。miR-148a-3p–ALDH1A3轴为PCOS的生物标志物开发及治疗靶点探索提供了新方向。

论文解读：miR-148a-3p通过ALDH1A3–视黄酸信号抑制颗粒细胞雌激素合成参与PCOS高雄激素表型的机制研究

多囊卵巢综合征（Polycystic Ovary Syndrome, PCOS）是育龄女性最常见的内分泌疾病，患病率约10%–15%，以卵巢功能障碍、雄激素过多（生化或临床高雄激素血症）、稀发/无排卵及多囊卵巢形态为特征，常伴肥胖、胰岛素抵抗及不孕。PCOS存在四种鹿特丹（Rotterdam）表型，但其异质性的 underlying pathomechanisms 仍未完全阐明。既往全基因组关联研究（GWAS）、表观遗传及基因表达研究表明非编码RNA尤其是microRNA（miRNA）可能参与卵巢功能的表观调控。miRNA多通过抑制靶基因mRNA翻译或稳定性负调控基因表达，但近年亦有激活转录的报道。循环中miRNA稳定存在且可在血清/血浆中检测，已有研究报道PCOS患者血清中存在差异表达（Differentially Expressed, DE）miRNA，但各研究结果重叠有限，且大多数DE miRNA在性激素生物合成及卵巢功能调控中的精确机制未被验证。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过对PCOS患者血清进行small RNA测序并结合类固醇特征亚组分析筛选与甾体生成相关的候选miRNA，并在肾上腺及卵巢细胞模型中验证其功能性作用，以阐明miR-148a-3p–ALDH1A3轴在PCOS卵巢类固醇生成紊乱中的意义。该论文发表于《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》。

主要关键技术方法：

研究人员收集土耳其伊斯坦布尔Yeditepe大学临床确诊的42例非糖尿病高雄激素PCOS女性患者（按AE-PCOS 2009标准诊断）及42例年龄匹配健康女性对照的空腹血清样本（队列此前已完成液相色谱-串联质谱LC-MS/MS血清甾体谱测定）。提取血清small RNA并行Illumina NovaSeq 6000 small RNA测序，以cel-miR-39为spike-in内参标准化，经miRMaster及EdgeR进行差异表达分析。依据前期14项显著性差异甾体参数（代谢产物、酶活性、通路速率）进行ROC分层及亚组DE miRNA交集聚类筛选候选miRNA。转染miRIDIAN miRNA mimics至人肾上腺皮质癌细胞NCI-H295R及人颗粒细胞样细胞HGL5、OVCAR-3、KGN，以Lipofectamine RNAiMAX转染，qPCR验证过表达效率。采用BRB-Seq法进行细胞mRNA测序并用DESeq分析差异转录本。雌二醇（Estradiol, E₂）采用ADVIA Centaur Enhanced E₂Assay检测，归一化至总蛋白。构建含ALDH1A3转录起始位点上游3000 bp启动子区的荧光素酶报告质粒，共转染HEK293T细胞与miR-148a-3p mimic，Dual-Luciferase Reporter Assay检测转录活性。统计学分析采用SPSS及R ggplot2软件。

研究结果

3.1. Demographic and biochemical characteristics of the study cohort

PCOS组平均年龄低于对照组（23.40±4.93 vs 28.04±5.65岁，p<0.001），体重、BMI、AMH（抗缪勒管激素）、多毛症、痤疮、月经不规则、高睾酮血症比例均显著高于对照组（p<0.05）。血清甾体分析显示PCOS组孕酮、20α-羟孕酮降低，雄烯二酮（Androstenedione, A4）、睾酮、雄酮、11-酮睾酮升高；17α-羟化酶活性升高，3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD/HSD3β）活性降低，芳香化酶（Aromatase/CYP19A1）活性降低，经典雄激素通路及雄激素后门（backdoor）通路速率升高，C11-氧通路及C11-氧后门通路速率亦升高（p<0.05），符合高雄激素PCOS特征。

3.2. Serum miRNA profile in PCOS versus controls

Small RNA测序鉴定出血清中36个DE miRNA。结合14项甾体亚组进行交集聚类分析后，筛选出4个在所有PCOS亚组中共同差异表达的miRNA：miR-148a-3p、miR-27a-3p、miR-144-3p及miR-144-5p，其中miR-27a-3p和miR-144-3p既往已有PCOS相关研究报道。miR-148a-3p在PCOS血清中显著上调，被选为首要功能验证候选分子。

3.3. Mechanistic validation of four candidate miRNAs in adrenal and ovarian cell models

在NCI-H295R肾上腺细胞中过表达四种candidate miRNA mimics均未影响雄激素合成相关基因表达及甾体谱。在HGL5人永生化颗粒细胞中，仅hsa-miR-148a-3p过表达显著上调ALDH1A3 mRNA表达（log₂FC=1.0249，校正p=6.157E-5）。生物信息学预测ALDH1A3启动子上游2335 bp处存在与miR-148a-3p seed region互补的7mer基序。荧光素酶报告实验显示共转染miR-148a-3p mimic与ALDH1A3 -3000 bp启动子质粒可使荧光素酶活性升高，证实miR-148a-3p对ALDH1A3具有转录激活作用。其余三种miRNA在HGL5细胞中未见明显基因表达谱改变。

3.4. hsa-miR-148a-3p increases ALDH1A3 and thereby regulates ovarian steroidogenesis

ALDH1A3催化全反式视黄醛转化为全反式视黄酸（all-trans Retinoic Acid, RA），文献已报道RA可抑制卵巢颗粒细胞E₂合成，且PCOS患者芳香化酶活性及E₂水平偏低。研究人员在HGL5细胞中过表达miR-148a-3p并加入A4（10 μM）作为E₂合成前体，结果显示ALDH1A3表达升高，培养上清E₂水平下降（p=0.064，具下降趋势且在OVCAR-3中达显著p=0.009）。在OVCAR-3及KGN卵巢颗粒样细胞中重复实验得到一致结论：miR-148a-3p过表达上调ALDH1A3，抑制E₂生成（OVCAR-3中E₂抑制p<0.01；KGN中趋势一致）。表明miR-148a-3p可通过转录激活ALDH1A3→增加RA合成→抑制芳香化酶介导的E₂合成，在卵巢颗粒细胞中发挥功能。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，PCOS各表型异质性强，循环miRNA作为调控因子受关注但缺乏功能验证。本研究通过结合甾体特征亚组分析缩小候选范围，首次在功能实验中证明miR-148a-3p可在颗粒细胞中转录激活ALDH1A3，促进RA合成进而抑制E₂产生，为高雄激素PCOS中雌激素相对不足及雄激素/雌激素失衡提供了一种分子解释。公开数据库（GEO GSE138572颗粒细胞、GSE92862膜细胞）显示miR-148a-3p在膜细胞中约2.5倍上调，颗粒细胞中差异不显著，反映PCOS细胞亚型特异性及表型异质性。局限性包括使用永生化/肿瘤细胞系而非原代PCOS颗粒/膜细胞、血清miRNA未必等同局部卵巢表达、不同研究间平台与分层差异。作者结论：miR-148a-3p在高雄激素PCOS患者血清中升高，其在卵巢来源细胞模型中过表达可增强ALDH1A3转录、促进RA合成并抑制E₂产生；miR-148a-3p–ALDH1A3轴可能为PCOS（尤其高雄激素亚型）的卵巢调控机制提供新视角，并具作为诊断生物标志物或治疗靶点的潜在价值，尚需原代细胞及体内模型进一步验证。