开发并应用了一种双重RT-qPCR检测方法，用于区分检测牛鼻病毒A型和B型基因型

《Journal of Virological Methods》：Development and application of a dual RT-qPCR assay for the differential detection of bovine rhinitis virus genotypes A and B

　　

刘丽萍|向家琳|史云鹏|曹冰蕾|高逸翔|王金凤|孙晓霞|王建昌

中国石家庄海关技术中心，石家庄050051

摘要

牛鼻病毒（BRV）是导致牛呼吸道疾病复合体（BRDC）的重要病原体。为了快速同时检测牛鼻病毒A型（BRAV）和牛鼻病毒B型（BRBV），我们设计并合成了针对病毒3D基因的特异性引物和TaqMan探针。在优化了引物和探针浓度以及退火温度，并全面评估了特异性、灵敏度和重复性后，成功开发了一种双重实时RT-PCR（RT-qPCR）检测方法，可以可靠地区分BRAV和BRBV。结果表明，该检测方法能够有效区分这两种病毒。此外，该方法与其他常见的牛呼吸道病原体（包括IDV、BVDV、BCoV、BRSV、BPIV3、IBRV、BAdV-3、M. bovis、M. haemolytica、P. multocida、C. perfringens和K. pneumoniae）无交叉反应，显示出高度的特异性。以体外转录的病毒3D基因RNA为模板，BRAV和BRBV的检测限（LOD）均为1.0×10^2拷贝/μL。通过将RNA浓度对数与相应的循环阈值（Ct）值作图得到的标准曲线，R^2值分别为0.994和0.999。最终，检测内的和检测间的变异系数均小于3%，表明该方法具有出色的重复性。使用该双重RT-qPCR方法分析了790份牛鼻拭子样本，结果显示BRAV的病毒核酸阳性率为3.79%（30/790），BRBV的阳性率为9.36%（74/790），共感染率为1.26%（10/790）。这种用于区分BRAV和BRBV的双重RT-qPCR方法具有高特异性、灵敏度和重复性，为牛产业中BRV感染的监测、流行病学调查以及有针对性的预防和控制提供了强有力的技术支持。

引言

牛鼻病毒（BRV）是一种无包膜的单链正链RNA病毒（Hollister等人，2008年）。根据国际病毒分类委员会（ICTV）的分类，BRV、马鼻病毒A型和口蹄疫病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridae）的Aphthovirus属（Rai等人，2016年；Zell等人，2017年）。BRV分为两种基因型：牛鼻病毒A型（BRAV）和牛鼻病毒B型（BRBV）（Devendra K和Rieder，2012年；Hollister等人，2008年）。该病毒会引起犊牛的上呼吸道感染，临床表现包括鼻黏膜充血和肿胀，以及气管和肺部的上皮损伤。这些症状通常伴有发热、鼻分泌物和呼吸频率增加（Bhattarai等人，2022年；Mohanty等人，1969年）。分子生物学和高通量测序技术的最新进展极大地推动了关于BRV的流行病学、基因组特征和发病机制的研究。这些研究表明，该病毒可能与其他呼吸道病毒协同作用，引发复杂的呼吸道疾病。

BRV是牛呼吸道疾病复合体（BRDC）的主要病原体（Ng等人，2015年；Zhai等人，2021年；Zhang等人，2019年）。在美国、墨西哥（Namita等人，2016年）、瑞典（Blomstr?m等人，2017年）、加拿大（Zhang等人，2019年）和日本（Ishida等人，2024年）的牛群中都发现了BRV感染。通过对美国和墨西哥饲养场牛的鼻拭子进行病毒宏基因组分析，发现BRAV和BRBV是主要的病原体，检出率分别为52.7%和23.7%（Namita等人，2016年）。同样，一项针对犊牛的加拿大研究显示，深鼻拭子样本中BRBV的阳性率为21.9%（Zhang等人，2020年）。中国的分子流行病学研究进一步证实，BRV在出现呼吸窘迫的牛群中广泛存在，表明它是BRDC病因中的关键病原体（Zhai等人，2021年；Zhou等人，2023年）。具体来说，Xie等人的研究在中国三个省份（广东、湖南和海南）收集的200份样本中显示BRV的感染率为11%（Xie等人，2021年）。BRV感染的临床表现与其他呼吸道病原体（如传染性牛鼻气管炎病毒IBRV和流感D病毒IDV）非常相似。此外，高频率的共感染使得临床鉴别诊断变得极具挑战性。因此，开发一种能够快速同时检测BRAV和BRBV的方法具有重要的实际价值。

目前，BRV的检测主要依赖于病毒分离、常规RT-PCR和单重RT-qPCR。然而，这些方法在临床应用中存在显著局限性。病毒分离不适用于快速诊断，因为它需要专门的设施、专业知识以及大量时间（Yamashita等人，1985年）。常规RT-PCR对病毒载量较低的样本灵敏度不足，而扩增后的处理步骤（如凝胶电泳）会增加交叉污染的风险（Koizumi等人，2025年）。此外，单重RT-qPCR每次反应只能检测一种基因型（Kishimoto等人，2017年）。由于BRAV和BRBV经常引起相似的临床症状或同时感染，单重检测方法需要分别进行多次检测，这大大增加了诊断成本、样本消耗和总体周转时间。

为了克服这些限制，本研究旨在开发一种快速可靠的双重实时荧光RT-PCR（RT-qPCR）检测方法。我们设计了针对BRAV和BRBV 3D基因的特异性引物和探针，并优化了反应成分和扩增条件。随后通过特异性、灵敏度和重复性的评估，以及标准曲线分析和临床样本的筛选，全面评估了该检测方法的性能。这种双重RT-qPCR方法能够在单次封闭管反应中同时检测和区分BRAV和BRBV，有效减少了劳动力、试剂消耗和周转时间。因此，它为BRV的快速临床诊断和大规模流行病学监测提供了高效、便捷的诊断工具。

章节片段

病毒和临床样本

我们实验室保存了BRAV、BRBV、IDV、IBRV、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛呼吸道合胞病毒（BRSV）、牛副流感病毒3型（BPIV3）、牛腺病毒3型（BAdV-3）、Mycoplasma bovis、Mannheimia haemolytica、Pasteurella multocida、Clostridium perfringens和Klebsiella pneumoniae的病毒基因组核酸。

时间范围为2021年4月至12月

双重RT-qPCR检测方法的优化结果

通过优化双重RT-qPCR反应系统和条件，结果显示最佳反应体系组成如下：12.5 μL 2×PerfectStart?探针一步qPCR超级混合液，0.5 μL转录探针一步RT/RI酶混合液，0.5 μL BRAV用RT-qPCR-F1/R1/P1（10 μmol/L），0.5 μL BRBV用RT-qPCR-F2/R2/P2（10 μmol/L），以及2 μL模板DNA，最终体积为25 μL（表2）。最佳反应条件如下：45°C

讨论

BRDC由多种病原体引起，不同病原体引起的临床症状非常相似。再加上共感染现象，这给BRDC的快速临床鉴别诊断带来了巨大挑战，导致全球牛产业遭受重大经济损失（Guo等人，2020年；Lynda等人，2021年）。基因组分析表明，在表现出BRDC症状的牛的鼻拭子或鼻咽拭子样本中，BRV是主要病原体之一

结论

本研究成功开发了一种用于同时检测BRAV和BRBV的双重RT-qPCR方法，该方法具有高特异性、灵敏度和优异的重复性。所开发的双重RT-PCR方法为BRV感染的监测、流行病学调查以及精准预防和控制提供了必要的技术支持。

CRediT作者贡献声明

王建昌：撰写——审稿与编辑，资金获取。史云鹏：验证，方法学。曹冰蕾：验证，数据管理。刘丽萍：撰写——初稿，方法学。向家琳：验证，方法学。高逸翔：验证，数据管理。王金凤：软件，数据管理。孙晓霞：软件，数据管理。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本文时，作者使用了DeepSeek工具来提高文章的可读性。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

资金支持

本研究得到了海关总署研究计划（2023HK035）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。