LNP递送IFN-α14-ApoAI mRNA用于慢性乙型肝炎的抗病毒疗效

《Journal of Virus Eradication》：Antiviral efficacy of LNP-delivered IFN-α14-ApoAI mRNA for chronic hepatitis B

　　

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV)感染仍是全球重大健康负担，当前治疗方案如聚乙二醇化干扰素-α (PEG-IFNα)临床疗效有限。研究人员开发了包封编码IFN-α₁₄-ApoAI融合蛋白mRNA的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNP)制剂，并在人源化IFNAR小鼠模型中评估其抗HBV活性和安全性。首先，腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)介导的IFN-α₁₄-ApoAI递送实现了安全且持续的HBV抑制，证明了该融合蛋白基因递送用于抗HBV治疗的可行性。在此基础上，研究人员将IFN-α₁₄-ApoAI mRNA配制为基于SM-102的LNP（命名为IFN-α₁₄ LNP）。单次静脉注射该LNP制剂可剂量依赖性地降低HBV抗原。此外，单次静脉注射4 μg IFN-α₁₄ LNP对HBV抗原的抑制效果与临床批准药物PEG-IFNα2（2 μg，皮下注射）相当。安全性评估显示，4 μg剂量耐受良好，未检测到器官毒性，仅出现一过性且自限性的细胞因子升高，以及可逆的脾脏免疫激活。然而，小鼠中重复给予IFN-α₁₄ LNP诱导了针对异种人IFN-α₁₄的中和抗体，这一局限性在人类中预计不会出现，因为人类对自身蛋白具有免疫耐受。综上所述，研究结果证明IFN-α₁₄ LNP在人源化IFNAR小鼠模型中发挥抗HBV活性并展现出良好的安全性特征，代表了一种仍需进一步优化的慢性乙型肝炎新型治疗候选方案。

该研究聚焦于慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)治疗领域亟待解决的临床需求。世界卫生组织估计全球约有2.54亿人患有慢性HBV感染，每年约120万人死于HBV相关肝硬化和肝细胞癌。当前CHB治疗方案主要包括PEG-IFNα和核苷（酸）类似物(nucleos(t)ide analogues, NUCs)。NUCs特异性靶向病毒逆转录酶活性，但对病毒蛋白表达抑制作用有限，大多数患者需要无限期给药。干扰素治疗虽具有确定疗程、无耐药性、HBeAg血清转换率高及潜在HBsAg清除等优势，但有限应答率和耐受性不佳限制了其临床应用。在此背景下，开发新型人干扰素-α亚型成为增强CHB治疗疗效的重要策略。

人IFN-α家族包含13个不同亚型，其中IFN-α₁₄被鉴定为所有IFN-α亚型中抑制HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)转录和病毒抗原产生最有效的亚型。其机制在于IFN-α₁₄以高亲和力结合I型干扰素受体(IFNAR)1，独特地协同激活IFN-α和IFN-γ信号通路，从而 robust 诱导广泛的干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)表达。与此同时，mRNA递送技术相较于质粒DNA和病毒载体具有独特优势：仅需进入细胞质即可瞬时启动蛋白翻译，消除插入突变风险，规避病毒载体相关免疫介导性肝炎等副作用。LNP可保护mRNA免受核酸酶降解，促进细胞摄取和胞质释放，已成为mRNA治疗的主要递送平台。静脉给药后，LNP通过结合载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)并经肝细胞ApoE受体介导摄取而优先在肝脏蓄积，这种固有肝细胞靶向特性使mRNA-LNP成为肝病治疗的理想平台。

研究人员采用的关键技术方法涵盖以下方面：利用AAV8载体介导的基因递送进行概念验证，采用人源化IFNAR小鼠(IFNAR-hEC小鼠，携带人IFNAR胞外域敲入)建立持续性HBV复制模型，运用基于SM-102的可离子化阳离子脂质与辅助脂质制备LNP并通过微流控混合技术实现mRNA包封，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清HBsAg、HBeAg及IFN-α水平，借助苏木精-伊红染色进行组织病理学评估，并开展转录组学分析比较不同处理组的差异表达基因。

**AAV介导IFN-α₁₄基因治疗的概念验证**

研究人员首先验证IFN-α₁₄基因治疗CHB的可行性。构建AAV8载体编码人IFN-α₁₄，单独表达或与小鼠ApoAI融合，由肝细胞特异性甲状腺素结合球蛋白(thyroxine-binding globulin, TBG)启动子驱动。在通过水动力注射(hydrodynamic injection, HDI)BPS复制子建立持续性HBV复制的IFNAR人源化小鼠中，AAV-IFN-α₁₄-ApoAI治疗使小鼠存活超过60天，而单独AAV-IFN-α₁₄在两周内导致致死性毒性。两种构型均显示两周内血清HBsAg水平下降趋势。AAV-IFN-α₁₄-ApoAI还显示将肝内3.5 kb及总HBV RNA抑制至对照水平约10%的趋势，且不降低BPS质粒DNA水平，为直接转录抑制提供初步证据。该结果证实ApoAI融合可保障安全性同时保留疗效。

**IFN-α₁₄ LNP的制备与表征**

基于AAV实验结果，研究人员制备包封IFN-α₁₄-ApoAI融合mRNA的LNP（简称为IFN-α₁₄ LNP）。该制剂平均粒径69.4 nm，多分散指数(polydispersity index, PDI)为0.22，包封效率达96.4%，具有良好的均一性，提示该颗粒能够有效从血管外渗并促进细胞摄取和内化。

**IFN-α₁₄ LNP的剂量探索与体内抗病毒活性**

在AAV-HBV转导的IFNAR-hEC小鼠中，研究人员通过单次静脉注射评估IFN-α₁₄ LNP的体内抗病毒效果。设置5倍系列剂量（20、4、0.8 μg包封mRNA）及对照LNP（EGFP LNP和空LNP）。结果显示血清IFN-α₁₄水平呈剂量依赖性升高，范围10–1000 ng/ml。IFN-α₁₄ LNP治疗显示剂量依赖性抗病毒活性趋势，而对照LNP无此效果。20 μg组出现1例死亡（n=2初始），20 μg剂量（n=1，探索性）出现红细胞和血小板减少，提示该剂量潜在血液学毒性。基于这些探索性观察，研究人员选择4 μg剂量进行后续研究。

**IFN-α₁₄ LNP与PEG-IFNα₂的体内抗病毒活性比较**

研究人员比较了IFN-α₁₄ LNP（4 μg，静脉注射）与临床批准药物PEG-IFN-α₂（2 μg，皮下注射）的疗效。两种处理在day 2对HBsAg和HBeAg显示相当抑制作用，但IFN-α₁₄ LNP效果更持久，HBsAg反弹更慢。Day 7时IFN-α₁₄ LNP对HBsAg抑制优于PEG-IFNα₂，并维持至day 10。血清IFNα水平检测显示，两组在day 1诱导相当水平（~100 ng/mL），后续时间点量级相同。肝脏转录组分析揭示，两种处理共有422个差异表达基因，但IFN-α₁₄ LNP特有基因（495个）远多于PEG-IFNα₂（195个）。在27个鉴定的差异表达ISGs中，25个在IFN-α₁₄ LNP组表达更高，包括抗HBV效应分子Mx1、Mx2和IFIT家族成员。基因本体论(Gene Ontology, GO)分析证实其富集于抗病毒和先天免疫通路。

**IFN-α₁₄ LNP的安全性和药效学评估**

综合安全性评估显示4 μg IFN-α₁₄ LNP耐受良好。各组间体重无显著差异。IFN-α₁₄ LNP和PEG-IFNα₂均在day 2诱导轻度、一过性ALT和AST升高（无统计学显著性），day 7恢复至基线，空LNP组无此现象，提示归因于表达的干扰素而非LNP载体。各组肌酐水平正常，无肝毒性或肾毒性。急性炎症评估显示，IFN-α₁₄ LNP组在3小时出现IL-6和TNF-α一过性升高，快速下降并于17小时恢复至接近基线，呈自限性急性期反应。脾脏大体检查显示IFN-α₁₄ LNP和PEG-IFNα₂组脾脏肿大、颜色变暗。组织病理学检查见白髓明显扩张、淋巴滤泡融合、红白髓边界模糊，且扩张区域主要由淋巴细胞组成。这些改变与IFN-α介导的淋巴细胞活化预期药效学效应一致，且具有可逆性——给药后四个月小鼠脾脏结构恢复正常。心、肝、肾、肺未观察到显著组织病理学改变。

**重复给药的免疫原性**

由于离子化阳离子脂质递送的人IFN-α₁₄对小鼠为异种蛋白，研究人员评估了重复给药的免疫原性问题。连续四次给药结果显示，IFN-α₁₄ LNP在第三剂后丧失HBsAg抑制能力，而PEG-IFN-α₂维持疗效。小鼠血清中检测到抗人IFN-α₁₄抗体，表明抗病毒活性丧失归因于针对人IFN-α₁₄的抗体产生。

讨论部分中，研究人员系统阐述了该研究的核心发现与局限。该概念验证研究证明LNP制剂的IFN-α₁₄-ApoAI mRNA在人源化IFNAR小鼠中具有抗HBV活性和良好安全性。4 μg剂量的IFN-α₁₄ LNP单次静脉注射与临床批准PEG-IFNα₂方案（2 μg皮下注射）在HBV抗原抑制方面相当，且效果更持久。AAV实验证实ApoAI融合改善了安全性，避免了单独IFN-α₁₄的致死性毒性。剂量探索研究表明20 μg与死亡和血细胞减少相关，而4 μg剂量耐受良好。脾脏改变为可逆性药效学效应而非退行性病变。然而，研究人员审慎指出，由于两种制剂给药途径不同显著影响吸收、分布和总体暴露，且关键药代动力学参数（C_max、T_max、AUC、半衰期）未测定，因此不能得出IFN-α₁₄ LNP优于PEG-IFNα₂的结论，该比较仅限固定条件下的方案层面。同时，缺乏功能验证也阻碍了关于IFN-α₁₄ LNP抗HBV效应确切机制的确定。研究局限性还包括AAV预实验和剂量探索研究的样本量较小（每组n=1-3），这些数据应视为探索性；主要结论由较大样本的比较疗效研究（每组n=5）和综合安全性评估（每组n=3）支持。

展望未来，研究人员提出进一步优化方向：应用mRNA工程新技术如深度生成AI平台GEMORNA设计增强翻译和稳定性的mRNA序列，或采用PASylation技术延长蛋白半衰期，可能协同增强IFN-α₁₄ LNP的药代动力学特性和疗效。关于重复给药的免疫原性，研究人员强调该小鼠模型中的中和抗体产生源于异种蛋白反应，而人类对自身蛋白IFN-α₁₄具有免疫耐受，可降低抗药物抗体形成风险；主要挑战在于LNP重复给药的聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)相关免疫原性，可通过制剂优化缓解。

研究结论指出，该概念验证研究证明LNP制剂的IFN-α₁₄-ApoAI mRNA在人源化IFNAR小鼠中发挥抗HBV活性并展现良好安全性特征。研究结果确立IFN-α₁₄ LNP方案为慢性乙型肝炎的新型候选疗法，值得进一步优化。该论文发表于《Journal of Virus Eradication》。