小鼠与人类胰腺导管腺癌癌前病变免疫微环境比较免疫谱分析揭示物种及病变类型依赖性的免疫微环境差异

《Laboratory Investigation》：Comparative immune profiling of murine and human pancreatic cancer precursors reveals species- and lesion-dependent immune microenvironments

　　

目的：本研究旨在比较表征小鼠与人类胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）癌前病变中的免疫微环境（immune microenvironment, iME），以更好理解其在胰腺癌变中的作用。材料与方法：构建含41只转基因小鼠（140个样本，含正常胰腺组织、腺泡?导管化生（acinar-ductal metaplasia, ADM）、胰腺上皮内瘤变（pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN）及PDAC）及76例患者（221个样本，含正常胰腺组织、ADM、PanIN、胰管内乳头状黏液性肿瘤（intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN）、黏液性囊性肿瘤（mucinous cystic neoplasm, MCN）及PDAC）的组织微阵列（tissue microarray, TMA）。采用OPAL? 7重多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）同时检测多种免疫细胞标志物（CD3、CD4、CD8、CD8α、FoxP3、PD?1、CD19、CD20、F4/80、CD68、CD163、类胰蛋白酶Tryptase及颗粒酶B Granzyme B），随后进行软件辅助的基于图像的定量。结果：除小鼠PanIN以CD19+B细胞为主外，各病变iME均以CD3+T淋巴细胞多于B淋巴细胞为特征。小鼠与人类PDAC均呈免疫抑制性iME。但癌前病变明显不同：小鼠ADM与PanIN未见免疫细胞显著增多，而人类ADM已显示肥大细胞、巨噬细胞、T辅助细胞及调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）升高；人类ADM、PanIN及胃型IPMN较正常胰腺组织CD8+细胞毒性T细胞显著增加，而PDAC中细胞毒性T细胞减少；肠型IPMN与MCN则未见细胞毒性T细胞增加。结论：上述发现提示iME在胰腺癌变过程中逐步演变，且在物种间及病变亚型间存在显著差异。小鼠模型未能完全再现人类疾病的免疫景观，强调临床前研究转化需谨慎。此外，人类不同癌前亚型具有独特免疫特征，提示存在病变类型特异性的免疫参与机制。

论文解读：《Comparative immune profiling of murine and human pancreatic cancer precursors reveals species- and lesion-dependent immune microenvironments》

一、研究背景与立项依据

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）预后极差，免疫检查点抑制剂单药治疗总体反应率低，被认为与其低肿瘤突变负荷及典型的免疫抑制/免疫逃逸性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）有关。既往研究多关注浸润性PDAC的免疫组成，而对癌变早期——即癌前病变阶段免疫微环境（immune microenvironment, iME）如何启动及演变知之甚少。常用的基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse model, GEMM）如Kras/P53突变小鼠被广泛用于临床前研究，但其iME是否真实反映人类癌前病变尚缺乏系统性比较。明确胰腺癌变进程中iME的动态变化、不同癌前亚型（腺泡?导管化生acinar-ductal metaplasia, ADM；胰腺上皮内瘤变pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN；胃型/肠型胰管内乳头状黏液性肿瘤intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN；黏液性囊性肿瘤mucinous cystic neoplasm, MCN）的差异，以及小鼠与人类之间的异同，对于理解免疫抑制起始机制及合理转化临床前免疫治疗数据至关重要。因此，研究人员开展了此项小鼠与人类PDAC及其癌前病变iME的比较免疫谱分析。

二、主要技术方法与样本来源

研究人员分别构建小鼠组织微阵列（TMA，1 mm芯，n=41只KC/KPC-like及Tenascin C TNC^-/-、Periostin POSTN^-/-敲除小鼠，共140个点）与人类TMA（2 mm芯，n=76例手术切除标本，2008–2016年杜塞尔多夫大学医院病理档案，共221个点），由病理医师重新按最新分类确认诊断。采用Opal? 7?色多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）标记CD3、CD4、CD8α、FoxP3、PD?1、CD19、CD20、F4/80、CD68、CD163、Tryptase、Granzyme B及DAPI，经共聚焦显微镜采集图像，使用FIJI/ImageJ编写宏进行半自动化阈值分割与阳性细胞计数，结果标准化为细胞数/mm2及标志物阳性细胞占DAPI⁺细胞的百分比。统计学采用Kruskal?Wallis检验与Dunn?Bonferroni校正（p<0.05为显著）。人组织另做p53免疫组化判断TP53状态。

三、研究结果

Innate immune response in mouse models of PDAC and its precursors（小鼠PDAC及其癌前病变的固有免疫反应）

通过mIF定量发现，小鼠PDAC（中心及外周）中类胰蛋白酶（Tryptase）⁺肥大细胞与F4/80⁺巨噬细胞较正常胰腺组织及ADM显著升高（p<0.05～0.01），其中多数F4/80⁺巨噬细胞共表达CD163（M2样）；但单独比较CD163⁺细胞比例在PDAC、PanIN、ADM与正常组织间无统计学差异。重要的是，小鼠ADM与PanIN中肥大细胞与巨噬细胞数量相较于正常小鼠胰腺均无显著增加。

Innate immune response in human PDAC and its precursors（人类PDAC及其癌前病变的固有免疫反应）

人类组织中，ADM、PanIN、胃型IPMN中Tryptase⁺肥大细胞比例较正常胰腺显著升高（p<0.001～0.021），而在PDAC中回降至接近正常水平。CD68⁺巨噬细胞与CD163⁺M2巨噬细胞在ADM（CD68中位22.16%，CD163中位12.59%）与PDAC（CD163中心区18.57%）均较正常胰腺（CD68 3.70%，CD163 4.39%）显著升高（p≤0.008）。不同癌前亚型各别样本巨噬细胞丰度范围较宽。

Adaptive immune response in mouse models of PDAC and its precursors（小鼠PDAC及其癌前病变的适应性免疫反应）

除PanIN以CD19⁺B淋巴细胞比例高于CD3⁺T细胞外，其余小鼠组织（正常、ADM、PDAC）均以T细胞为主。CD4⁺T辅助细胞为最主要T细胞亚群，中心区PDAC中CD4⁺比例较ADM显著升高（p=0.008）；FoxP3⁺调节性T细胞（Treg）占比极低（各组织中位<0.5%）；CD8α⁺/Granzyme B⁺细胞毒性T细胞在各组织类型间无显著差异；PD?1⁺细胞轻度升高但无统计学意义。

Influence of mouse genotype on iME（小鼠基因型对iME的影响）

Tp53野生型小鼠胰腺组织中CD3⁺T细胞数显著高于Tp53杂合或纯合敲除小鼠（p<0.05）。额外敲除胞外基质蛋白Tenascin C（TNC）或Periostin（POSTN）对小鼠PDAC或癌前病变任何免疫细胞浸润比例未观察到可量化影响。

Adaptive immune response in human PDAC and its precursors（人类PDAC及其癌前病变的适应性免疫反应）

所有人类胰腺组织（含各癌前病变及PDAC）均以CD3⁺T细胞为主而非B细胞，且PanIN低级别亦无B细胞优势。CD4⁺T辅助细胞与FoxP3⁺Treg在ADM、PanIN、胃型IPMN及PDAC中较正常胰腺显著升高（p≤0.043与p<0.001），肠型IPMN与MCN无此差异。CD8⁺细胞毒性T细胞在正常胰腺低（中位1.31%），在ADM（5.34%）、PanIN（3.94%）和胃型低级别IPMN（3.73%）显著升高（p≤0.007），但在肠型IPMN、MCN及PDAC中与正常无差异。PD?1⁺细胞在ADM、PanIN、胃型IPMN及PDAC中较正常轻微但显著升高。人组织p53异常表达（过表达/缺失）与CD3⁺T细胞丰度无显著关联。

四、讨论与结论总结

研究人员指出，人类胰腺癌变过程中iME呈动态演变：ADM阶段即已出现CD163⁺M2巨噬细胞、CD4⁺T辅助细胞及FoxP3⁺Treg富集，提示癌前病变具主动免疫招募与免疫调节能力；CD8⁺细胞毒性T细胞在ADM、PanIN及胃型IPMN一过性升高后于PDAC中耗竭/减少，符合PDAC最终形成免疫抑制微环境。不同癌前亚型免疫谱不同——胃型IPMN与PanIN/ADM相似而有细胞毒性T细胞升高，肠型IPMN与MCN则否，可能反映起源细胞与致癌通路差异或进展阶段相关。小鼠模型中ADM/PanIN未见上述免疫细胞显著变化且PanIN以B细胞为主，说明常用GEMM未能完全模拟人类癌前免疫激活，临床前免疫治疗数据外推需谨慎。Tp53缺失降低小鼠T细胞浸润，或间接参与免疫抑制；TNC与POSTN敲除未引起可量化免疫细胞数改变，不排除其通过空间隔离或功能调控（如CD8⁺T细胞滞留）发挥质的影响需空间转录组等技术探明。研究强调胰腺癌前病变本身具免疫活性，为早期干预提供理论依据。

结论（翻译自原文Conclusion）：

上述发现表明，免疫微环境在胰腺癌变过程中发生演变，且在物种及病变类型间存在显著差异。小鼠模型的免疫景观并未完全重现人类疾病特征，强调将临床前发现向临床转化时需谨慎。此外，人类不同癌前亚型具有独特的免疫表型，提示存在病变类型特异性的免疫参与机制。

—发表于《Laboratory Investigation》