《The Lancet Microbe》：Real-world emergence of nirsevimab resistance in breakthrough infections with respiratory syncytial virus-B: a multicentre observational study in France
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摘要
背景 呼吸道合胞病毒（RSV）是婴儿下呼吸道感染的主要病因之一。尼塞维单抗（nirsevimab）是一种靶向预融合F蛋白（fusion protein，F protein）保守表位（epitope）——site Φ——的长效单克隆抗体，在临床试验和早
摘要
背景 呼吸道合胞病毒（RSV）是婴儿下呼吸道感染的主要病因之一。尼塞维单抗（nirsevimab）是一种靶向预融合F蛋白（fusion protein，F protein）保守表位（epitope）——site Φ——的长效单克隆抗体，在临床试验和早期真实世界研究中显示出较高有效性。尽管尚未报告广泛性耐药，但对于逃逸变异株（escape variants）出现的担忧仍然存在，尤其是在RSV-B病毒中。法国2024–25年RSV流行季中，RSV-B占据优势，为大规模考察RSV-B突破性感染及其耐药性提供了独特机会。本研究旨在采用基因型和表型方法表征RSV对尼塞维单抗的逃逸。
方法 本研究为POLYRES-2项目的一部分，是一项在法国医院场景（住院与门诊）开展的多中心、全国性、观察性研究，时间覆盖2024–25年RSV流行季。研究纳入年龄≤1岁的婴儿，均在常规诊疗中经逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）证实为RSV感染，无论是否接受过尼塞维单抗。研究对象通过各医院病毒学实验室数据库识别。研究要求各参与中心在整个研究期间纳入数量相对平衡的尼塞维单抗暴露与未暴露感染婴儿。临床数据来自电子病历。研究人员比较了接受尼塞维单抗婴儿与尼塞维单抗初治（naive）婴儿中RSV对尼塞维单抗的敏感性。对呼吸道样本进行RSV全长基因组测序。为确保结果可靠，系统发育分析和突变分析仅限于基因组覆盖度≥90%且尼塞维单抗结合位点具有完整测序读段的高质量序列。研究还对临床RSV分离株进行了尼塞维单抗中和试验，并采用融合抑制实验（fusion inhibition assay）分析F蛋白候选替代。主要结局为RSV F蛋白site Φ中是否存在耐药相关替代（resistance-associated substitutions，RASs），以及是否存在对尼塞维单抗的表型耐药。
结果 在1023例RSV感染婴儿中，858例（83·9%）获得了RSV全长基因组序列：其中419例（48·8%）来自尼塞维单抗治疗后突破性感染〔212例（50·6%）为RSV-A，207例（49·4%）为RSV-B〕，439例（51·2%）来自尼塞维单抗初治婴儿〔192例（43·7%）为RSV-A，247例（56·3%）为RSV-B〕。在195例RSV-A突破性感染中有2例（1·0%）检测到RASs；在184例RSV-B突破性感染中有23例（12·5%）检测到RASs。RSV-A中唯一的RAS为F:K209E，可赋予中等程度耐药。RSV-B中的耐药不仅较RSV-A更常见，而且更加多样：23株耐药病毒中有12株（52.2%）在208位残基存在替代〔F:N208D、F:N208I、F:N208K、F:N208S或F:N208Y〕。其他新型替代包括F:I64V/F:K65E、F:K68I、F:L204S和F:P205S，也可介导耐药。值得注意的是，在预防用药近1年后仍检测到一株耐药RSV-B变异株（F:N208S）。在尼塞维单抗初治婴儿中未检测到耐药RSV。
解释 RSV-B对尼塞维单抗的耐药可在真实世界环境中出现，约影响12%的突破性感染，且其多样性高于既往认识，尽管基于现有证据，其临床影响仍然受限。于预防用药后较长时间仍检出耐药变异株，提示有必要开展延长性的基因组监测。整合临床与病毒学数据对于维持RSV单克隆抗体项目的长期有效性至关重要。
该文发表于《The Lancet Microbe》，聚焦尼塞维单抗（nirsevimab）在法国真实世界应用后，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）尤其是RSV-B突破性感染中耐药性的出现及其分子基础。RSV是婴幼儿急性下呼吸道感染的重要病原体，也是住院、重症监护室（ICU）收治和婴儿期疾病负担的重要来源。随着母体疫苗和靶向RSV融合蛋白（fusion protein，F protein）的长效单克隆抗体投入使用，婴儿期RSV预防进入新阶段。尼塞维单抗靶向预融合F蛋白上的保守表位site Φ，在临床试验和早期真实世界研究中均显示出较高保护效果。然而，单克隆抗体策略的一个核心局限在于病毒逃逸：个别关键氨基酸改变即可显著削弱抗体中和活性。既往关于尼塞维单抗耐药的证据总体有限，尤其是RSV-B病例数量偏少，无法充分刻画耐药相关替代（resistance-associated substitutions，RASs）的频率、类型及其临床相关因素。法国自2023年起实施全国性尼塞维单抗婴儿免疫项目，到2024–25流行季，RSV-B成为优势流行株，为大规模研究RSV-B突破性感染中的耐药选择提供了现实条件。
研究人员据此开展POLYRES-2多中心全国观察性研究，纳入法国32家医院在2024年9月16日至2025年4月23日期间就诊的1岁及以下RSV感染婴儿，覆盖住院与门诊人群。研究核心目的并非评价预防有效性本身，而是通过基因型与表型联合分析，系统监测尼塞维单抗暴露后突破性感染中RSV的逃逸现象，重点解析RSV-B耐药的发生比例、分子多样性及相关临床特征。研究结果显示，尼塞维单抗耐药在RSV-A中极为罕见，但在RSV-B中并不少见；在RSV-B突破性感染中，约12.5%存在可降低药物敏感性的变异，并且变异谱较既往报道更复杂。与此同时，未接受尼塞维单抗的婴儿中未发现耐药株，这一结果支持耐药主要是在药物选择压力下新生出现，而非人群中已广泛传播。总体上，研究提示尼塞维单抗在真实世界中仍保持较高总体临床效益，但必须辅以持续、延长周期的分子监测，以保障单克隆抗体防控策略的长期可持续性。
在方法学上，研究主要采用以下关键技术路径：第一，基于法国32家医院队列建立前瞻性多中心观察性监测体系，收集经RT-PCR证实的RSV感染婴儿临床资料与呼吸道样本；第二，开展RSV全长基因组下一代测序（next-generation sequencing，NGS）并进行系统发育分析、位点突变筛查及少数变异群体（minority variants）分析；第三，对成功分离的临床病毒株进行微量中和实验（microneutralisation assay）评估尼塞维单抗敏感性；第四，对新发现或可疑F蛋白位点替代构建重组表达体系，采用融合抑制实验（fusion inhibition assay）测定ICf50变化，从而完成耐药表型验证。
在研究结果部分，论文首先报告了整体队列构成与基础特征。研究共纳入1023例RSV阳性婴儿，排除缺失关键资料者后，对980例进行全长基因组测序，最终获得858份高质量序列用于分析。其中419例为尼塞维单抗暴露后的突破性感染，439例为未暴露婴儿。突破性感染组与未暴露组平均年龄相近，但前者早产儿比例更高，且ICU收治比例更低，提示接受预防的婴儿虽仍可感染，但整体临床严重度指标较低。
随后，“系统发育与谱系分析”部分显示，RSV-A与RSV-B在研究期间于法国全境共同传播。RSV-A主要分为AD.1、AD.3和AD.5相关谱系，RSV-B主要分为B.D.4.1与B.D.E.1相关谱系。不同谱系总体临床特征相似，但B.D.E.1在突破性感染中的比例相对偏低。该部分说明，耐药现象并非由某一单一聚集传播事件主导，而是在多谱系背景下散发出现。
在“病毒分离株的表型敏感性检测”部分，研究人员首先对能够成功培养的42份样本进行微量中和实验。由于这些分离株均未携带site Φ中的RASs，因此所有检测到的病毒均对尼塞维单抗保持敏感，不同组别和谱系之间IC50无显著差异。该结果一方面说明常规可培养样本中未直接捕获明显耐药株，另一方面也提示仅依靠病毒分离培养不足以反映真实耐药谱，需要结合基因组与功能实验。
在“site Φ氨基酸替代筛查及功能验证”部分，研究系统筛查了F蛋白尼塞维单抗结合位点的氨基酸变异，并对新发现替代进行了融合抑制实验验证。在尼塞维单抗未暴露组中，仅观察到既往已知的不影响敏感性的天然多态性，另有1例RSV-B新型F:Q210L，经功能实验确认不降低药物敏感性。此结果非常关键，因为它表明在人群自然传播背景中，并未见到耐药位点的显著富集。
在“RSV-A突破性感染中的耐药特征”部分，195例RSV-A突破性感染中仅2例携带新型F:K209E替代。功能实验显示，该替代导致中度耐药，ICf50倍数变化为10.6±1.4。除该位点外，RSV-A未发现其他RASs。该结果与论文整体判断一致，即RSV-A对尼塞维单抗具有较高遗传耐药屏障（genetic barrier）。
在“RSV-B突破性感染中的耐药特征”部分，184例RSV-B突破性感染中有23例存在RASs，占12.5%。其中9例携带既往已报道耐药位点，包括F:I64T、F:K68E、F:K68N、F:N208S和F:N208D；另有14例携带此前未充分描述的新型替代或组合替代，包括F:K68I、F:L204S、F:P205S、F:N208I、F:N208K、F:N208Y，以及F:N63S/I64V、I64M/K65E、F:K68I/L204S、F:P205S/N208K、F:I64T/N201T/L204S等组合。功能实验进一步证明，F:208位点的I、K、Y替代可导致高度敏感性下降，而F:N208S保留部分敏感性；F:L204S、F:P205S和F:K68I也造成高度耐药；单独的F:I64V、F:I64M影响较小，但与F:K65E联合出现时则表现出明显协同作用，导致高度耐药。该部分是全文的核心，显示RSV-B耐药不仅频率高于RSV-A，而且分子机制具有显著异质性，其中208位残基是最关键的逃逸热点。
在“耐药相关临床因素”部分，研究比较了23例携带RAS的RSV-B突破性感染与未携带RAS的RSV-B突破性感染。结果显示，耐药组婴儿年龄更大，高风险基础疾病比例显著更高，且距尼塞维单抗给药时间更长。这提示随着药物暴露后时间延长、抗体水平下降，以及宿主存在基础疾病或可能更长的病毒复制过程时，耐药新生出现的机会可能增加。
在“跨流行季残余选择压力”部分，研究特别分析了前一RSV季接受尼塞维单抗、而在后一流行季发生感染的婴儿。23例此类病例中，有8例感染RSV-B，其中1例检出F:N208S，且距预防给药已接近1年。该观察提示，在第二个RSV季中，残余的亚中和抗体浓度仍可能施加选择压力，促成耐药株出现。这是本研究具有政策意义的重要发现之一，因为它直接关系到监测窗口的设定。
讨论部分围绕几个层面展开。首先，研究确认尼塞维单抗耐药在真实世界中确可发生，但主要集中于RSV-B，并且其位点谱和组合形式比既往认识更复杂。其次，研究强调208位残基在RSV-B逃逸中的中心作用，同时指出204、205、68以及64/65组合位点也具有重要功能意义。再次，未暴露婴儿中未发现耐药株，且耐药病例呈散发、非聚集分布，支持这些变异多为选择压力下的新生事件，而非已在群体中稳定传播。研究还指出，突破性感染总体严重度较低，结合当季法国报告的较高真实世界保护效果，说明尽管耐药存在，其目前整体临床影响仍有限。与此同时，作者也明确了研究局限，包括医院基础招募可能低估社区病例、临床严重度变量有限、各中心入组数量不均、研究设计并非因果效果分析，以及体外敏感性与体内适应性、传播性之间的对应关系尚待明确。
研究结论部分可译为：研究结果提供了重要证据，表明RSV-B对尼塞维单抗的耐药可在真实世界条件下出现，且其多样性与复杂性高于既往认识。令人宽慰的是，法国报告的尼塞维单抗较高真实世界有效性提示，这些耐药变异株的临床影响较小。此外，在感染RSV-A或RSV-B的尼塞维单抗初治婴儿中均未检测到耐药变异株，这强有力地支持耐药变异株尚未在人群水平发生传播。未来持续整合临床、病毒学与药理学数据，对于维持RSV单克隆抗体项目的长期有效性至关重要。
