死后全血中检测SARS-CoV-2 RNA血症的一种RNA提取方法的评价

《Legal Medicine》：Evaluation of an RNA extraction method to detect SARS-CoV-2 RNAemia in postmortem whole blood

　　

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）RNA血症，即血液中存在SARS-CoV-2 RNA，与2019冠状病毒病（COVID-19）的严重程度相关。虽然在临床研究中通常使用血清或血浆进行病毒RNA提取，但由于死后变化，法医死后标本中的血清分离往往困难。本研究旨在建立一种从死后全血中高效提取SARS-CoV-2 RNA的方法，并利用实际案例标本评估其法医适用性。研究人员比较了酸胍硫氰酸-酚-氯仿（AGPC）、旋转柱（SC）和磁珠三种提取方法，以确定全血标本中SARS-CoV-2 RNA提取的高效方法。AGPC方法获得了最高的病毒RNA回收率，但可重复性有限。因此，研究人员评估了一种改良的AGPC-SC方法，即对全血进行均质化处理，然后进行AGPC相分离，并使用SC方法进行纯化。该程序在保持病毒RNA产量的同时提高了可重复性。与血清相比，优化方法对COVID-19病例死后全血样本的阳性符合率为85.3%，阴性符合率为92.5%。全血和血清病毒RNA载量呈强相关性（Spearman's ρ = 0.9014），Bland-Altman分析显示平均差异较小（-0.053 log₁₀ copies/μL）。因此，死后全血可作为血清的替代标本，而涉及均质化的AGPC-SC方法为法医实践中SARS-CoV-2 RNA提取提供了一种实用方法。

该论文发表于《Legal Medicine》（法律医学），研究背景始于SARS-CoV-2于2019年底出现并引发全球大流行。COVID-19在多数情况下为无症状或轻症，但老年人和有基础疾病者重症及死亡风险增加。重症COVID-19可导致严重下呼吸道疾病，包括肺炎和急性呼吸窘迫综合征。此外，COVID-19已被认识为一种累及多器官的全身性疾病，重症病例中多个器官检测到病毒RNA，提示病毒通过血液系统播散。RNA血症，即血液中存在SARS-CoV-2 RNA，据报道与COVID-19严重程度相关，重症病例血浆中病毒RNA检出率更高，且血浆病毒RNA水平与疾病严重程度和死亡率相关。因此，从法医尸检或外检病例血液样本中检测SARS-CoV-2 RNA，可能为生前疾病严重程度提供支持性证据，并有助于死因判定。在临床研究中，血浆或血清通常用于病毒RNA检测，但法医标本受死后变化影响，血清分离困难，因此需要一种可在法医实践中使用的死后全血SARS-CoV-2 RNA检测方法。

研究人员开展了以下研究：首先比较了AGPC、SC和磁珠三种RNA提取方法在全血中的效率，随后优化并评估了AGPC-SC联合方法，并将优化方法应用于75例法医外检病例（包括74例配对全血/血清标本和1例无法分离血清的特殊病例），通过定性及定量分析评估死后全血作为血清替代标本的可行性。研究得出以下主要结论：AGPC-SC联合均质化方法在保持高病毒RNA产量的同时显著提高了可重复性；死后全血与血清病毒RNA载量呈强相关性，且系统偏差极小；死后全血可作为血清的替代标本，AGPC-SC均质化方法为法医实践中SARS-CoV-2 RNA提取提供了实用策略。该研究对于拓展法医病理学中RNA血症检测的适用范围、在无法获得血清时仍能评估生前COVID-19严重程度具有重要实践意义。

研究人员为开展本研究主要采用了以下关键技术方法：使用SARS-CoV-2培养上清液对人全血、血浆及纯化水进行加标实验以模拟生物基质条件；采用RT-dPCR（逆转录数字PCR）技术对SARS-CoV-2 N基因N2区域进行绝对定量，以病毒RNA载量（copies/μL）及阳性分区数作为检测指标；建立了AGPC-SC联合提取流程，包括不锈钢珠机械均质化（3200 r/min，1 min）、AGPC相分离及SC纯化步骤；使用QIAcuity One数字PCR系统进行病毒RNA定量；对74例法医外检配对标本（心脏血来源，中位死后间隔时间24小时）进行方法学验证，并通过Spearman秩相关、Bland-Altman分析等统计方法评估全血与血清结果的一致性。

研究结果部分保留原文小标题并概述如下：

**3.1 适于全血的病毒RNA提取方法的确定**
通过对AGPC、SC和磁珠三种方法在加标全血、血浆及纯化水中的比较，AGPC方法从全血中获得最高病毒RNA产量（15,315 copies/μL，相对值0.84），但变异系数（CV）为13%；SC方法在全血中产量最低（5,500 copies/μL）；磁珠方法在全血中产量亦较低（6,808 copies/μL）且CV更高（23%）。AGPC方法提取的全血总RNA浓度最高（30.0±3.5 ng/μL），而SC和磁珠方法提取的纯化水和血浆总RNA浓度接近定量下限。该结果表明AGPC方法最适用于全血标本的病毒RNA提取。

**3.2 死后全血病毒RNA提取方法的优化**
研究人员比较了AGPC单独法、AGPC-SC联合法以及增加均质化步骤的AGPC-SC方法。AGPC单独法虽产量最高（15,315 copies/μL），但CV为13%；AGPC-SC联合法将CV降至7%，但产量下降至13,012 copies/μL；而增加均质化步骤后，AGPC-SC方法产量恢复至14,731 copies/μL（与AGPC单独法相近），且CV显著降低至2%，表现出最佳的可重复性。总RNA浓度也从无均质化的7.1±1.4 ng/μL增加至9.1±1.3 ng/μL，表明均质化改善了全血中的RNA回收。

**3.3 死后血液病毒RNA提取方法的实践评估**
将优化的AGPC-SC均质化方法应用于75例法医标本。内源性对照RNase P在所有可用全血和血清提取物中均被检出。在74例配对标本中，以血清为比较标准，全血的阳性符合率（PPA）为85.3%（29/34），阴性符合率（NPA）为92.5%（37/40）。定量分析显示全血与血清病毒RNA水平呈强相关性（Spearman's ρ = 0.9014，P < 0.0001）。Bland-Altman分析显示平均差异为-0.053 log₁₀ copies/μL，95%一致性界限为-0.762至0.657 log₁₀ copies/μL，表明两种标本类型间变异有限。全血和血清的总RNA浓度与SARS-CoV-2 RNA载量均无显著相关性；死后间隔时间（PMI）与病毒RNA载量亦无显著相关性。在1例无法分离血清的特殊病例（溺水死亡，PMI约3天，尸体表面已出现腐败变色，全血浓缩伴小凝血块）中，优化方法检出24 copies/μL，而SC方法仅检出5 copies/μL，验证了优化方法在困难标本中的适用性。

讨论部分的核心要点如下：研究人员指出，RNA血症在SARS-CoV-2、流感病毒和呼吸道合胞病毒感染中均有报道，与疾病严重程度和死亡率相关。既往研究主要关注血源性病毒的死后检测，而针对SARS-CoV-2等呼吸道病毒RNA血症的法医学检测信息有限。本研究通过生物相关基质条件下的加标实验，确定了AGPC方法因不依赖固相支持而适用于全血等复杂标本，但存在变异性较高的局限；进而通过AGPC与SC结合并引入均质化步骤，在保持高产量的同时显著提高了可重复性。均质化可能通过改善样本均匀性、促进病毒RNA从血细胞及凝块中释放而增强提取效率。在法医标本验证中，全血与血清的高度一致性支持了全血作为替代标本的可行性；少数不一致病例均为低拷贝数（1-5 copies/μL）样本，更可能源于检测限附近的随机变异而非系统性差异。研究人员还讨论了全血可能保留血清中未完全体现的细胞相关病毒RNA，这为重症COVID-19评估提供了额外信息。研究局限性包括：定量分析的病例数有限；血清并非完美参照标准；优化方法在严重死后变化标本中的优势未系统评估；以及方法仅限于SARS-CoV-2，对其他RNA病毒的适用性有待研究。

研究结论部分翻译如下：死后全血可作为血清的替代标本。据此，AGPC-SC均质化方法可为法医实践中死后血液SARS-CoV-2 RNA的提取提供一种实用方法。此外，涉及其他病毒的研究可能进一步拓展该方法在法医领域的应用价值。