综述：关于通过DNA甲基化进行法医年龄估算的研究：近期进展及未来在法律年龄估算领域的方向

《Legal Medicine》：A survey on forensic age estimation through DNA methylation: recent progress and future directions towards legal age estimation

罗德里戈·冈萨雷斯-罗梅罗（Rodrigo Gonzalez-Romero）| 维多利亚·苏亚雷斯-乌略亚（Victoria Suarez-Ulloa）| 奥斯卡·伊巴涅斯（Oscar Iba?ez）
Panacea合作研究有限公司（Panacea Cooperative Research S.C.）
地址：C.Ramón y Cajal, 33, 24400 Ponferrada, 西班牙

**摘要**
DNA甲基化（DNAm）已成为年龄估计（Age Estimation, AE）中最有前景的分子生物标志物之一，为传统的人类学和放射学方法提供了强有力的补充。其应用范围涵盖法医学、生物医学和人道主义领域，特别是在识别死者身份和估算活体人员的法定年龄方面。尽管DNA甲基化技术发展迅速，但基于该技术的年龄估计模型在法医学实践中的应用仍面临验证问题、数据集多样性以及组织特异性变异性的挑战。本综述提供了2019年至2025年间开发的基于DNA甲基化的年龄估计模型的最新概述。我们根据数据来源、组织类型、甲基化量化方法和数学模型对这些模型进行了分类和分析，并区分了用于估算活体人员实际年龄的模型和用于估算死者死亡时年龄的模型。分析结果显示，目前的研究趋势包括针对组织特异性的模型优化、使用少量标记物的靶向方法，以及整合机器学习以提高预测性能。特别值得关注的是针对儿童和年轻人的表观遗传时钟的开发，这些时钟在移民和儿童保护等社会和人道主义背景下具有日益重要的意义。通过总结主要的方法学进展、局限性和挑战，本文为下一代基于DNA甲基化的年龄估计模型指明了发展方向，强调了标准化验证协议、增加样本多样性以及跨学科整合分子生物学、放射学和计算工具的必要性。

**引言**
年龄估计（Age Estimation, AE）是法医学的关键组成部分，在刑事调查和人道主义工作中具有广泛应用。准确确定个人年龄有助于识别无名遗骸、处理涉及未成年人的案件，并协助其他法律程序。传统上，年龄估计依赖于骨骼和牙齿结构的分析，但具体方法取决于目标是估算死者的死亡时年龄还是活体的实际年龄，以及是进行广泛评估还是确定特定年龄范围。对于死者，年龄估计通常通过观察骨骼和牙齿的形态学（基于视觉阶段的观察）和形态测量学（线性测量）方法进行。在成人中，这涉及评估特定解剖区域的退行性变化，如耻骨联合[1]、髂骨耳状面[2]、胸骨肋骨末端[3]、颅缝[4]以及牙齿指标（如牙根透明度和次级牙本质沉积[5]）。而在未成年人中，年龄估计基于生长和发育过程中的变化，包括初级和次级骨化中心的出现和融合、骺板闭合的时间以及牙齿发育阶段（如钙化和萌出[6]）。尽管这些方法已经较为成熟，但它们存在一些重要局限性：耗时且容易出错，需要大量培训才能达到所需的精度；依赖于基于相对较少且可能存在祖先偏见的样本的分类系统；并且具有较大的观察者间和观察者内变异性。此外，其精度也受到限制，尤其是在成人中，估算的年龄范围可能超过十年。为了解决这些问题并提高准确性，越来越多的多因素和统计驱动方法（如Navega及其同事提出的方法[7]）被纳入应用。

对于活体人员，特别是在涉及未成年人的法律情境中，欧洲的年龄评估遵循《庇护程序条例》（2024/1348）第25条的规定，并遵循欧盟庇护局（EUAA）的指南。当对未成年人申报的年龄存在合理怀疑时，这些规定要求采用多学科方法，包括收集文件和证词证据，并尽可能优先选择侵入性较小的程序。尽管如此，骨骼发育的放射学评估仍然是最常用的医学检测方法[8]。常见方法包括使用Demirjian方法评估第三磨牙[9]、使用Greulich和Pyle图谱评估腕骨融合[10]，以及根据Schmeling的方法评估锁骨骺板融合[11]。这些方法旨在为法律程序提供依据，以确定个人是否超过法定年龄阈值（例如18岁），但由于其侵入性，这些方法引发了伦理争议。一些非政府组织和国际组织批评使用X射线，因为辐射暴露问题；不过研究人员指出，法医学年龄估计所需的辐射剂量极低。例如，自然背景辐射的年平均辐射剂量约为3.1 mSv，而手部和腕部X射线的剂量仅为0.0001 mSv，数字全景X射线的剂量在0.005至0.01 mSv之间[12]。除了伦理考虑外，这些方法还受到人群特异性变异的影响，需要专家解读，并且结果存在不确定性，通常超过2岁，这在18岁等法定年龄阈值附近尤为重要。为应对这些挑战，最近的创新包括使用人工智能（AI）自动分析放射学图像，从而提高传统年龄估计方法的效率和可重复性[13],[14]。

在这种背景下，DNA甲基化（DNAm）作为一种分子方法，在活体和死者年龄估计中变得越来越重要。DNA甲基化是一种表观遗传机制，通过向DNA中的胞嘧啶（尤其是CpG位点，即DNA序列中连续的胞嘧啶和鸟嘌呤，通常位于称为CpG岛的多重复序列中）添加甲基基团来调节基因表达。DNA甲基化参与细胞分化和生物体发育，同时也受到表观遗传漂变的影响（即随时间累积的随机修饰），因此能够反映细胞和整个生物体的生命周期阶段[15]。这一特性被用于开发表观遗传时钟（即从DNA甲基化模式估算年龄的数学模型），在生物医学和法医学领域有广泛应用[16],[17]。大量关于表观遗传时钟的研究来自临床领域，其中表观遗传年龄估计有助于预测病理过程、评估脆弱性和死亡风险，并加深我们对人类衰老过程的理解[16],[18],[19],[20]。虽然临床研究侧重于利用DNA甲基化估算个体的生物学年龄（即样本的细胞或生物体健康状况），但法医学的目标是尽可能准确且无偏见地估算实际年龄（即出生到现在的时间跨度），以作为法律程序的工具。年龄估计方法的发展和完善，特别是基于DNA甲基化的方法，可以提升各种场景下的法医学能力。尽管这些方法仍存在局限性和偏见（本文将对此进行讨论），但它们有可能为法律和人道主义工作提供高效工具，帮助全球范围内的人员识别和保护。基于DNA甲基化的年龄估计方法在这些领域具有显著优势，能够实现批量分析、加快处理速度，并比依赖法医人员手动经验的传统方法更具客观性。

死后DNA甲基化年龄估计模型在估算死亡时年龄方面比传统人类学技术更具客观性和准确性。此外，它们不依赖于骨骼的完整性或特定解剖区域的可用性。基于DNA甲基化的年龄估计可以使用少量组织（无论是软组织还是硬组织），因此在处理部分、碎片化或腐烂的遗骸时特别有价值。在自然灾害或种族灭绝等大规模伤亡事件中，基于DNA甲基化的方法还可以减少传统方法的耗时性，提高分析效率，从而改进灾难受害者识别（Disaster Victim Identification, DVI）协议的效率[21],[22],[23]。在某些情况下，基于DNA甲基化的方法可能是唯一的可行年龄估计方法。当缺乏有用的解剖区域或尸体本身无法获取时（例如犯罪现场仅留下生物样本时），DNA成为识别个人的唯一信息来源。即使没有直接用于DNA比对的参考样本，结合表观遗传时钟和其他预测生物特征的模型（甚至是对面部外观的完整法医DNA分型），也能生成关键的调查线索，否则这些线索可能难以发现，导致案件无法解决[24]。

在法定年龄阈值附近进行准确和客观的年龄估计是一项非常重要的任务，因为这些阈值标志着特定的权利和责任（如成年年龄、刑事责任和同意权），对个人的生活具有重大影响。与非通用型法医DNA甲基化年龄估计模型不同，专为狭窄年龄范围（如12-25岁）开发的DNA甲基化模型可以通过捕捉青少年和年轻成人时期DNA甲基化模式的快速变化来实现更高精度。尽管该领域的研究仍处于起步阶段，但最近的DNA甲基化研究在法定年龄估计方面显示出潜力[25],[26]。通过专注于特定法定年龄范围内的年龄组，这些模型有助于在需要医学检测的情况下改进年龄估计结果。

本综述提供了2019年至2025年间发表的关于法医学背景下基于DNA甲基化的年龄估计模型的最新概述。虽然之前的综述为该领域奠定了重要基础，但没有一项研究能涵盖与本工作相同的时间跨度。例如，Maulani和Auerkari[27]汇编了一项基于DNA甲基化的法医年龄估计模型的系统综述，但其覆盖范围仅限于2019年，未能反映近年来的快速方法学进展。更近期的出版物在多个方面推动了该领域的发展。Correia Dias及其同事[28]深入探讨了DNA甲基化的生物学基础及其在法医年龄估计中的重要性，强调了组织特异性变异性和未来的方法学挑战。Naue[29]进一步扩展了这一研究，探讨了与年龄相关的表观遗传动态，并提出了适用于不同法医场景的标记物选择策略。Refn及其同事[30]关注实际应用问题，指出了当前模型的进展和局限性，特别是考虑到法医案例工作的验证要求。最近，Castagnola及其同事[31]强调了基于DNA甲基化的年龄估计在人类识别中的适用性，重点关注法医案例类型和样本条件。我们的综述在此基础上，对最新的基于DNA甲基化的年龄估计模型进行了分类和分析，同时探讨了它们在法定年龄确定和灾难受害者识别等场景中的实用性。此外，我们还探讨了人工智能和计算技术如何塑造下一代法医年龄估计工具。因此，本文不仅提供了最新的研究进展概述，还为DNA甲基化在法医学、法律和人道主义应用中的未来发展提供了路线图。

**术语和范围**
文献中提出了多种基于DNA甲基化的年龄估计方法，这些方法在复杂性和数据分析方法上有所不同。我们的综述涵盖了过去七年（2019-2025年）发表的具有法医学应用的基于DNA甲基化的年龄估计技术。图1按组织类型和体液类型、DNA甲基化分析方法、数学模型、供体状况和数据来源对这些方法进行了分类。

**结果与讨论**
从回顾的出版物中提取的所有数据汇总在表1中，提供了研究结果的简要概述。如需更详细的信息，读者可以参考补充表1，其中提供了此处数据的扩展版本。

**结论**
基于DNA甲基化量化的法医年龄估计在过去十年中受到了广泛关注。与早期研究相比，该领域已从主要以概念验证为主的研究（主要基于血液样本和有限的方法集）发展为更加多样化和应用导向的方法。近年来，人们为提高预测准确性、验证方法论以及加速适合法医学应用的协议开发做出了努力。

**作者贡献**
奥斯卡·伊巴涅斯（Oscar Iba?ez）提出了本综述的想法。罗德里戈·冈萨雷斯-罗梅罗（Rodrigo Gonzalez-Romero）和维多利亚·苏亚雷斯-乌略亚（Victoria Suarez-Ulloa）负责文献搜索和数据分析。罗德里戈·冈萨雷斯-罗梅罗（Rodrigo Gonzalez-Romero）起草了初稿。维多利亚·苏亚雷斯-乌略亚（Victoria Suarez-Ulloa）参与了手稿的起草工作，并对其进行了细致的修订。奥斯卡·伊巴涅斯（Oscar Iba?ez）从学术内容的角度对论文进行了重要的修改。所有作者都阅读并批准了最终版本的手稿。

**资金支持**
冈萨雷斯-罗梅罗博士（Dr. Gonzalez-Romero）的研究工作得到了MICIU/AEI的支持（项目编号：PTQ2023-013171）。苏亚雷斯-乌略亚博士（Dr. Suarez-Ulloa）的研究工作得到了MCIN/AEI的支持（项目编号：PTQ2022-012683）。伊巴涅斯博士（Dr. Ibá?ez）的研究工作得到了西班牙科学、创新与大学部（Ministry of Science, Innovation and Universities）的资助（项目编号：RYC2020-029454-I），以及加利西亚自治区政府（Xunta de Galicia）的资助（项目编号：ED431F 2022/21）。我们感谢加利西亚大学系统（Galician University System）下属的中信集团（CITIC）所提供的支持。

**利益冲突声明**
作者声明：他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。