《Materials Today Bio》：Supercritical CO2–Decellularized amniotic ECM hydrogel promotes immunomodulatory skin regeneration
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急性紫外线B（ultraviolet B，UVB）暴露可引发快速皮肤炎症，其特征为免疫细胞浸润、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解及组织功能障碍。尽管目前的保湿敷料、透明质酸/胶原制剂及外源性生长因子等治疗策略具有一定益处，但由
急性紫外线B（ultraviolet B，UVB）暴露可引发快速皮肤炎症，其特征为免疫细胞浸润、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解及组织功能障碍。尽管目前的保湿敷料、透明质酸/胶原制剂及外源性生长因子等治疗策略具有一定益处，但由于其调节受损皮肤炎症及再生微环境的能力有限，不足以促进全面再生。本研究提出一种通过超临界二氧化碳（supercritical carbon dioxide，scCO?）脱细胞技术制备的脱细胞猪羊膜（decellularized porcine amniotic membrane，dPAM）水凝胶。该方法可有效去除免疫原性细胞成分，同时保留含血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）及Decorin（核心蛋白聚糖）等ECM相关生物活性分子。值得注意的是，dPAM水凝胶保留了基质结合蛋白如Decorin，其与组织再生及毛囊生物学相关的Wnt信号通路有关。体外研究表明，dPAM水凝胶可促进内皮细胞血管生成，并减弱巨噬细胞M1型相关促炎反应。此外，其可增强人毛囊来源真皮乳头细胞（human follicle-derived dermal papilla cells，HFDPCs）的促再生及毛囊相关基因响应，提示dPAM水凝胶可能影响Wnt相关再生信号。在UVB诱导的皮肤炎症小鼠模型中，该水凝胶表现出双重功能——既可减弱早期免疫反应又可促进组织修复。综上，这些发现凸显了dPAM水凝胶作为一种基于生物活性ECM的平台，能够为皮肤修复创造促再生微环境，在光损伤相关皮肤损伤及更广泛的再生生物材料策略中具有潜在应用价值。
论文解读：《Supercritical CO?–Decellularized amniotic ECM hydrogel promotes immunomodulatory skin regeneration》（发表于Materials Today Bio）
一、研究背景与立项依据
紫外线B（UVB）辐射是引起皮肤光老化、免疫抑制及癌变的重要环境因素。急性UVB暴露可诱发表皮及真皮炎症级联反应，导致促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）释放、中性粒细胞浸润、活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生及细胞外基质（ECM）广泛降解，同时破坏毛囊干细胞微环境，损害皮肤稳态与再生能力。目前临床常用的保湿敷料、透明质酸、胶原制剂及外源性生长因子仅能提供被动湿润环境或部分促上皮化作用，存在半衰期短、生物利用度低及无法主动调控早期免疫紊乱等局限，难以实现全面皮肤再生。脱细胞羊膜（amniotic membrane，AM）基质因富含生长因子（VEGF、PDGF、EGF）、抗炎因子（IL-10、HLA-G）及结构ECM成分成为有前景的再生材料，但传统去垢剂或酶法脱细胞易致生物活性分子丢失及化学残留。超临界二氧化碳（scCO?，>31.1℃、>73.8 bar）兼具气体扩散性与液体溶解性，可在无强化学试剂条件下高效去除免疫原性细胞成分并较好保留ECM架构与基质结合生物活性分子（matrix-bound bioactive molecules）。本研究由韩国科学技术研究院（KIST）团队开展，旨在利用scCO?技术制备脱细胞猪羊膜（dPAM）水凝胶，验证其保留的生物活性成分对UVB致皮肤炎症的免疫调节、促血管生成、ECM重塑及毛囊相关再生的促进作用，评估其作为生物活性ECM敷料的潜力。
二、主要关键技术方法概要
研究人员以猪胎盘分离羊膜（porcine amniotic membrane，PAM）为原材料，经梯度乙醇脱水后采用scCO?（300–350 bar，37℃，6 h，助溶剂为100%乙醇）脱细胞处理，辅以DNase消化残留核酸制得dPAM，冻干研磨成粉；另设1% SDS脱细胞组作传统方法对照。dPAM粉末经胃蛋白酶-乙酸溶液溶解、MEM及NaOH中和后于37℃形成2%（w/v）热敏dPAM水凝胶，以3 mg/mL I型胶原水凝胶为对照。通过H&E及Masson三色（Masson's trichrome，MT）染色、DNA/胶原/糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）定量、猪细胞因子芯片及液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）蛋白质组学（含GO、KEGG及STRING蛋白互作网络分析）表征dPAM理化与生化为效。以人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblasts，HDFs）CCK-8及人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）活/死染色评估细胞相容性；Transwell间接共培养下分别进行HUVECs成管实验、LPS+IFN-γ诱导THP-1源M1样巨噬细胞炎症基因（TNF-α、IL-1β、IL-6）qRT-PCR检测、人毛囊真皮乳头细胞（HFDPCs）再生/免疫/Wnt相关基因（VEGF、ANGPT1、TGF-β1、IL-10、IDO-1、MICA、Wnt3、β-catenin）qRT-PCR检测。体内采用6周龄雄性C57BL/6小鼠构建单次高剂量UVB（500 mJ/cm2）急性皮肤炎症模型，于照后次日单次局部应用dPAM水凝胶（300 μL）、胶原水凝胶或PBS，Tegaderm膜覆盖至第5天，观测至第14天；通过大体照相、H&E及MT染色（测表皮厚度与毛囊密度）、免疫荧光（myeloperoxidase，MPO标记中性粒细胞；CD68及CD206标记巨噬细胞表型；I型胶原COL1、III型胶原COL3）评估抗炎、组织重塑及毛囊再生效果。
三、研究结果
2.1. Fabrication and structural-biochemical characterization of dPAM（dPAM制备及结构-生化表征）
scCO?脱细胞后H&E染色证实细胞核物质被有效清除，MT染色显示胶原纤维排列致密均匀。dPAM残留DNA降至83.9±4.87 ng/mg（符合脱细胞标准），GAG保留约原生PAM的90%（7.23±0.36 μg/mg vs 8.11±0.25 μg/mg），胶原含量因细胞成分移除而相对富集（11.14±0.62 μg/mg vs 8.27±0.31 μg/mg），且显著优于SDS组对GAG和胶原的保留率。细胞因子阵列显示Decorin、IL-28B与原生组相当，VEGF、PDGF-BB仅轻度下降仍具水平。蛋白质组学鉴定253个蛋白（79个共有），脱细胞后胞质蛋白减少，ECM关联蛋白（转铁蛋白TF、补体C3、过氧化物还原酶5 PRDX5等）被保留；GO/KEGG富集伤口愈合调节、ECM结合及黏附斑（focal adhesion）通路；PPI网络显示dPAM富集ECM组织与免疫调节蛋白互作簇，提示保留的蛋白网络参与炎症调控与组织修复。
2.2. Surface and mechanical characterization of dPAM hydrogel（dPAM水凝胶表面及力学表征）
优选2%（w/v）dPAM可形成稳定水凝胶，扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）示平均孔径约40–120 μm互联多孔结构。流变学测得储能模量G′约125–300 Pa高于损耗模量G″（70–100 Pa），优于3 mg/mL胶原水凝胶（G′≈30–50 Pa）。溶胀实验30 min达约350%，平衡于约400%；37℃ PBS中7天内保持结构完整，且在pH 5–9间降解行为无显著差异，具生理条件下稳定性。
2.3. In vitro evaluation of dPAM hydrogel（dPAM水凝胶体外评价）
HDFs与dPAM间接共培养24 h存活率约85%，HUVECs直接接触培养大部分存活，表明良好细胞相容性。Transwell下dPAM水凝胶条件培养基显著促进HUVECs成管节点数、线段数及网孔数（较未处理组及胶原水凝胶组升高），归因于保留的VEGF/PDGF。LPS+IFN-γ诱导M1样巨噬细胞与dPAM共培养后，促炎基因TNF-α与IL-1β显著下调，IL-6适度降低，表明dPAM减弱M1相关促炎信号。HFDPCs与dPAM共培养后，血管生成基因VEGF与ANGPT1、Wnt通路基因Wnt3与β-catenin、免疫调节基因TGF-β1、IL-10及IDO-1均上调，提示dPAM可能影响真皮乳头细胞Wnt/β-catenin信号并营造促再生免疫微环境。
2.4. In vivo evaluation of dPAM hydrogel（dPAM水凝胶体内评价）
UVB损伤小鼠中，dPAM水凝胶组红斑消退快、第14天残余创面面积最小。H&E示第5天dPAM组中性粒细胞浸润明显少于对照组，第14天表皮增厚（UVB典型炎症表现）被抑制至接近Sham水平，并可见毛囊样结构；量化示dPAM组毛囊密度显著高于未处理（NT）及PBS组。免疫荧光第5天示dPAM组MPO?中性粒细胞比例最低，CD206?（M2样表型关联）巨噬细胞信号增加；第14天I型胶原（COL1）荧光强度及COL1/COL3比值升高，提示ECM成熟重塑。结果表明dPAM水凝胶在体内可抑制早期炎症细胞招募、促进向修复性免疫表型偏移、加速胶原成熟及营造利于毛囊附属器再生的微环境。
四、讨论与结论翻译
讨论指出本研究局限性包括未检测系统性血清细胞因子及免疫器官反应、仅使用雄性小鼠、部分实验样本量偏小，需在后续研究中扩展。但多层面组织学、免疫荧光及基因表达结果趋势一致，支持生物学解释。
结论翻译：
本研究利用scCO?脱细胞工艺制备了dPAM水凝胶，可有效保留关键生物活性分子。该水凝胶在UVB诱导皮肤炎症的体外及体内模型中显示出再生与抗炎潜力——促进血管生成、减弱局部炎症反应、支持ECM重塑，并营造与毛囊相关再生响应关联的组织微环境。结果强调dPAM水凝胶不仅可作为创面敷料，更可作为基于生物活性ECM的平台在原位递送基质关联信号线索。不同于仅提供湿润环境的传统敷料，该水凝胶结合了结构性ECM支持与保留的促再生及免疫调节因子，在皮肤创面管理与修复策略中具有潜在应用价值；其兼具生物相容性、结构完整性及天然ECM组分保留能力，为受损组织皮肤再生与炎症调控提供了有前景的生物材料策略。
