斯提尔病（Still's disease）中代谢-免疫交互作用的识别：单核/巨噬细胞来源的免疫代谢物衣康酸通过CXCL10-CD8 T细胞轴调控肝脏免疫病理

《Experimental & Molecular Medicine》：Identification of a metabolic–immune crosstalk in Still’s disease: monocyte/macrophage-derived immunometabolite itaconate dictates hepatic immunopathology via the CXCL10–CD8 T cell axis

　　

斯提尔病（Still's disease，SD）是一种慢性系统性自身炎症性疾病，可导致危及生命的并发症，包括巨噬细胞活化综合征（macrophage activation syndrome，MAS）。SD/MAS免疫病理学背后的代谢-免疫交互作用在很大程度上尚未被探索。在本研究中，研究人员将衣康酸（itaconate）——一种通过酶ACOD1从三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环衍生的髓系细胞特异性代谢物——鉴定为SD/MAS中炎症和趋化因子驱动组织损伤的双重调节因子。临床代谢组学揭示了SD患者血清衣康酸的升高，这可归因于外周血单核细胞并与疾病严重程度相关。这一发现在MAS小鼠模型的单核细胞和巨噬细胞以及体外细胞培养中鉴定的Acod1–衣康酸轴中得到了巩固。尽管衣康酸在体外抑制IL-1β、IL-6、CXCL1和CCL2，但其矛盾地放大了体内外的CXCL10分泌。这与MAS患者血浆CXCL10水平升高的观察结果一致。在CpG ODN 1826诱导的MAS小鼠模型中，Acod1的缺失改善了疾病表现和肝脏炎症，伴随CXCL10水平的降低以及肝脏CD8⁺ T细胞浸润的减弱。总之，该研究揭示了AOSD/MAS中此前未被认识的代谢-免疫交互作用，将单核/巨噬细胞来源的衣康酸定位为一种双重调节因子，其抑制经典促炎细胞因子的同时却促进CXCL10介导的CD8⁺ T细胞驱动的组织损伤。因此，该研究的发现呼吁对慢性炎症性疾病中基于衣康酸的抗炎策略进行审慎审视。

斯提尔病（Still's disease，SD)是一种以细胞因子风暴介导的并发症为特征的系统性自身炎症性疾病，其中巨噬细胞活化综合征（macrophage activation syndrome，MAS)是一种危及生命的超炎症状态，且常常对IL-1β/IL-6靶向治疗耐药。现有疗法在严重SD/MAS中的有限疗效凸显了识别免疫病理学新驱动因素的必要性。新出现的证据表明，通过Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs)对病原体相关分子模式和损伤相关分子模式的异常感知可引发SD发作，进而触发NLRP3炎症小体激活以及IL-1β、IL-6和IL-18的过度产生，同时激活I型（IFN-α/β）和II型（IFN-γ）干扰素通路。这些反应协同驱动炎症级联反应的放大。然而，将这些先天免疫触发因素与失调的适应性免疫反应联系起来的精确分子机制仍不完全清楚。SD中的先天和适应性免疫失调表现为经典和非经典单核细胞亚群的扩增、中性粒细胞活性的增强以及淋巴细胞群体的偏移。趋化因子网络在SD中协调这些免疫细胞转变中起关键作用。一个关键而未解决的问题是，什么驱动了SD/MAS中这些致病性趋化因子的异常产生。

免疫代谢学这一快速兴起领域的研究揭示了多种代谢物作为免疫细胞功能的新型调节因子。这些代谢物（近期 termed 免疫代谢物）通过调节基因表达、信号通路、表观遗传等途径影响免疫细胞，超越了代谢在传统生物能量学和生物合成中的作用。衣康酸是这些免疫代谢物中最引人注目的一种，其合成由可诱导酶乌头酸脱羧酶1（aconitate decarboxylase 1，ACOD1)（亦称免疫反应基因1，immune-responsive gene 1，IRG1)从三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环衍生而来。尽管许多研究证明了衣康酸衍生物在巨噬细胞中的抗炎作用，但后续研究表明原始衣康酸确实具有免疫调节性而非单纯的抗炎性。研究人员此前观察到衣康酸对LPS刺激巨噬细胞中CXCL10产生的促进作用，以及对IL-6和IL-12β分泌的降低作用。鉴于SD/MAS以先天免疫激活和IFN信号为特征——这些过程已知受衣康酸调节——研究人员假设衣康酸作为连接先天过度激活与适应性细胞毒性的关键免疫代谢节点。

该研究发表于《Experimental & Molecular Medicine》，研究人员开展了以下工作：通过临床队列分析、动物模型构建和体外细胞实验，系统探究了衣康酸在SD/MAS中的免疫代谢调控作用。研究样本来自2018年9月至2020年3月期间上海交通大学医学院附属瑞金医院风湿免疫科招募的20例活动期SD患者，以及相匹配的健康对照。此外还利用了此前发表队列的样本数据（GSE247993，E-GEAD-397）。动物实验使用C57BL/6N野生型小鼠和Acod1^-/-基因敲除小鼠，采用CpG ODN 1826腹腔注射建立MAS样模型。

关键技术方法包括：液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography/mass spectrometry，GC-MS）进行代谢组学分析；流式细胞术进行免疫表型分析；定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR）检测基因表达；蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白水平；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和LEGENDplex^?多因子检测技术进行细胞因子/趋化因子定量；以及免疫组织化学染色。

**活动期SD患者中单核细胞来源的衣康酸升高并与疾病严重程度相关**

研究人员对SD患者血清进行了TCA循环及其相关代谢物的靶向代谢组学分析。与健康对照相比，SD患者表现出丙酮酸（2.013倍）、衣康酸（2.095倍）和α-酮戊二酸（1.494倍）水平升高，而柠檬酸、乌头酸、异柠檬酸和琥珀酸水平降低。值得注意的是，血清衣康酸水平与全身性疾病严重程度评分呈正相关，表明衣康酸是SD严重程度的代谢生物标志物。研究人员还观察到血清衣康酸水平与外周单核细胞计数（而非中性粒细胞或淋巴细胞）呈正相关。进一步发现ACOD1 mRNA在SD患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中上调，RNA测序分析显示ACOD1表达主要在经典（CD14⁺⁺CD16^-）和非经典（CD14⁺CD16⁺）单核细胞中，而非其他免疫亚群。与此一致，SD患者单核细胞中IRG1蛋白水平显著升高。研究人员还比较了伴或不伴MAS的SD患者外周血单核细胞中ACOD1的表达，观察到MAS患者中ACOD1表达显著更高。这些结果共同揭示了外周单核细胞特异性ACOD1–衣康酸轴在SD/MAS进展中的意义。

**CXCL10和CD8⁺ T细胞与巨噬细胞活化综合征的关联**

鉴于SD/MAS患者循环单核细胞中ACCL1表达高于无MAS患者，研究人员进一步探索与MAS相关的系统性炎症指标。在外周血中，研究人员首先确认了可溶性IL-2受体（soluble IL-2 receptor，sIL-2R）的升高，这是MAS的常见生物标志物和T细胞过度激活的指标。此外，观察到SD/MAS患者中CXCL10和IL-10水平显著增加。与外周血免疫表型分析一致，这些患者中CD8⁺ T细胞百分比升高。进一步分析显示，血浆CXCL10与血清IL-10和sIL-2R呈正相关，但与血小板计数呈负相关。血浆CXCL10水平还与丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）相关，这两者是常与SD严重程度相关的肝损伤标志物。关键的是，血浆CXCL10水平与CD8⁺ T细胞百分比呈正相关。这些结果共同揭示了SD/MAS进展中潜在的CXCL10–CD8⁺ T细胞轴。

**小鼠巨噬细胞活化综合征样模型中Acod1/衣康酸通路的激活**

为探究衣康酸在MAS发病机制中的作用，研究人员利用CpG ODN 1826诱导的小鼠模型，该模型重现了人MAS的关键临床特征。CpG攻毒小鼠出现血小板和红细胞数量特征性减少，血清IL-6、IL-18和TNF-α水平升高，伴随CXCL10、CXCL1和CCL2的显著增加。值得注意的是，这些动物表现出外周淋巴细胞减少伴代偿性中性粒细胞增多，模拟了SD/MAS患者中观察到的血液学表现。

与SD患者血清衣康酸升高一致，CpG攻毒小鼠表现出循环衣康酸增加。组织特异性基因表达分析显示，CpG刺激小鼠的肝脏和脾脏中Acod1表达上调。在这些组织中，黏附细胞（单核/巨噬细胞）中的细胞内衣康酸积累更为明显，表明它们是衣康酸的主要产生者。此外，来自CpG处理小鼠的腹腔巨噬细胞表现出Acod1诱导和细胞内衣康酸积累，这与跨物种单核细胞谱系中保守的衣康酸合成一致。

**CpG在单核/巨噬细胞中转录激活ACOD1-IRG1-衣康酸轴**

研究人员进一步阐明CpG ODN 1826是否直接激活ACOD1–IRG1–衣康酸轴。分析CpG激活小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）的胞内代谢物，观察到这些激活的巨噬细胞中衣康酸显著产生，而对照细胞中没有。衣康酸的下游代谢物中康酸（mesaconate）也在CpG刺激的BMDMs中积累，提供了衣康酸产生激活的额外证据。TCA循环中间产物琥珀酸在CpG刺激的BMDMs中显著升高，这与衣康酸诱导的琥珀酸脱氢酶活性抑制一致。在蛋白水平上，CpG明显诱导BMDMs中IRG1表达，这在Acod1缺陷小鼠的BMDMs中完全被消除。Acod1 mRNA的时间进程分析显示其快速激活，在6小时达到峰值后逐渐下降。最后，通过CpG诱导的人外周血单核细胞和小鼠脾单核/巨噬细胞中ACOD1的上调，研究人员确认了CpG诱导的Acod1表达不仅存在于巨噬细胞，也存在于其前体单核细胞中。

**衣康酸对CpG激活的单核/巨噬细胞中细胞因子/趋化因子产生的复杂调控**

考虑到衣康酸在LPS刺激单核/巨噬细胞中的免疫调节作用已被充分确立，研究人员进一步探究其在CpG处理单核/巨噬细胞中是否同样如此。尽管低剂量外源性衣康酸倾向于增加CpG刺激的IL-6分泌，但较高剂量的衣康酸减少了CpG刺激BMDMs的IL-1β和IL-6分泌。为阐明内源性衣康酸的作用，研究人员采用Acod1基因敲除（knockout，KO）小鼠品系。Acod1的基因缺失加剧了CpG诱导的BMDMs和脾脏单核/巨噬细胞中IL-1β/IL-6基因表达和蛋白释放，表明内源性衣康酸的抗炎活性。

鉴于CXCL10在MAS发展中的意义，研究人员进一步探究衣康酸在CpG诱导趋化因子产生中的作用。外源性衣康酸的添加显著降低了CpG刺激BMDMs中CCL2和CXCL1的表达和分泌。相反，外源性衣康酸在基因表达和分泌蛋白水平均增强了CpG刺激的CXCL10产生。这一效应与衣康酸对IL-1β和IL-6的抑制作用相反。研究人员此前发现非衍生化衣康酸增强LPS诱导的CXCL10产生，当前研究将这一发现扩展至TLR9驱动炎症。此外，衣康酸而非其衍生物增强CXCL10的效应也在CpG刺激的人和小鼠单核细胞中观察到。Acod1缺陷降低了CpG处理小鼠BMDMs和单核细胞中的CXCL10表达，表明内源性和外源性衣康酸在增强CXCL10产生方面具有一致作用。RNA测序分析进一步确认了衣康酸对细胞因子和趋化因子表达的免疫调节效应：其促进Cxcl10、Cxcl3和Cxcl5表达，同时降低IL1a、IL-1b和IL-12b表达。

为理解ACOD1–CXCL10轴的临床相关性，研究人员分析了患者来源单核细胞的转录组数据。在SD单核细胞中，观察到ACOD1与CXCL10表达水平之间存在显著正相关。这种相关性在以巨噬细胞活化为主的SD中比在以适应性免疫为主的系统性红斑狼疮中更为显著，表明ACOD1–衣康酸轴与CXCL10产生在巨噬细胞驱动病理中可能存在优先偶联。

**ACOD1决定全身性疾现表现和肝脏免疫病理**

为确定体外观察到的衣康酸免疫调节效应的病理相关性，研究人员在CpG ODN 1826诱导的MAS模型中应用了Acod1缺陷小鼠品系。Acod1的基因缺失显著减轻了全身性疾病表现，表现为脾肿大减轻和贫血/血小板减少改善。循环细胞因子和趋化因子谱分析显示，与野生型小鼠相比，Acod1^-/-小鼠中CpG诱导的IL-6、TNF-α和IL-18产生显著降低。与此并行，Acod1缺陷选择性降低了CXCL10而非CCL2/CXCL1分泌，反映了培养巨噬细胞和单核细胞中鉴定的特异性衣康酸–CXCL10轴。

肝脏炎症与MAS发病机制相关，肝损伤是包括MAS在内的严重SD的标志。研究人员的结果也提示CXCL10水平与SD伴MAS患者肝损伤之间的相关性。在CpG诱导的MAS模型中，肝脏基因表达分析显示Acod1缺陷小鼠中Il1b、Il6、Tnf和Cxcl10表达显著降低，表现为肝脏炎症改善。免疫组织化学和流式细胞术分析一致显示，与野生型肝脏相比，Acod1缺陷小鼠肝脏中CpG触发的CD45⁺白细胞浸润减少。进一步的免疫表型分析揭示了Acod1缺陷小鼠肝脏中T细胞比例的降低，这在B细胞、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞中未观察到，这与本研究中鉴定的衣康酸–CXCL10轴一致，因为CXCL10以其对T细胞的强效趋化效应而闻名。最后，研究人员鉴定出CD8⁺ T细胞而非CD4⁺ T细胞为Acod1缺陷所减少的T细胞亚群。这些结果共同表明，内源性衣康酸是通过选择性促进肝脏CD8⁺ T细胞积累而导致实验性MAS进展的主要因素。

在讨论部分，研究人员首先强调了该研究揭示的SD/MAS中此前未被认识的代谢-免疫交互作用，将单核/巨噬细胞来源的衣康酸定位为抑制经典促炎细胞因子的同时却促进CXCL10介导的CD8⁺ T细胞驱动组织损伤的双重调节因子。研究人员指出，SD患者血清衣康酸的升高及其与单核细胞计数和疾病严重程度的相关性，提示其可能参与疾病相关的单核/巨噬细胞激活、炎症反应和病理损伤。这一临床观察在MAS小鼠模型和体外细胞培养的单核细胞和巨噬细胞中鉴定的Acod1–衣康酸轴中得到了巩固。

研究人员进一步阐述了免疫代谢物衣康酸的双重免疫调节特性：虽然其抗炎作用在多种炎症环境和疾病模型中已有充分文献记载，但其对CXCL10的促进作用揭示了更为复杂的免疫调节谱。该研究将这一双重范式从LPS刺激扩展至TLR9驱动炎症，建立了衣康酸作为免疫调节剂而非广谱抗炎剂的定位——其抑制一组经典促炎细胞因子和趋化因子，但增强Cxcl10、Cxcl3和Cxcl5表达。这种在不同TLR刺激（TLR4和TLR9）中的一致性突出了非衍生化衣康酸基本且可重复的免疫调节特征。有趣的是，衣康酸衍生物如4-OI和DMI普遍抑制这些细胞因子和趋化因子的产生，提示原始衣康酸与其合成衍生物之间存在不同的作用机制。

关于CXCL10在SD/MAS中的病理意义，研究人员指出CXCL10——一种介导CXCR3⁺ T细胞（包括CD8⁺ T细胞）趋化的多效性趋化因子——在自身免疫病中升高并触发效应T细胞 trafficking 和干扰素驱动病理。在该研究中，血浆CXCL10能够区分MAS与非MAS SD，使其成为分层生物标志物。临床观察显示SD/MAS患者循环CD8⁺ T细胞比例增加，且与血浆CXCL10水平正相关。这些临床模式在CpG诱导的MAS模型中得到了重现，其中Acod1缺陷显著降低血清CXCL10水平和肝脏CD8⁺ T细胞浸润，同时不影响血清CCL2/CXCL1浓度或髓系细胞招募，最终改善MAS相关临床症状和全身性炎症。CXCL10是招募致病性CD8⁺ T细胞进入肝脏的关键趋化因子，而这些CD8⁺ T细胞是该模型中组织损伤和全身性炎症的主要驱动因素。因此，Acod1^-/-小鼠中衣康酸的缺失破坏了这一关键的CXCL10–CD8⁺ T细胞轴，进而减少CD8⁺ T细胞相关组织损伤和炎症反应。

研究人员还特别讨论了IFN-γ–CXCL10轴与衣康酸–CXCL10轴的关系。虽然IFN-γ是CXCL10的另一个经典诱导因子，在MAS中发挥关键作用，但衣康酸并未显示出与IFN-γ诱导CXCL10表达的协同效应。Acod1敲除也不影响IFN-γ诱导的CXCL10表达。因此，衣康酸似乎并非CXCL10表达的通用调节器，而更像是通路特异性调节器。这种对TLR9驱动的CXCL10通路的选择性放大揭示了MAS等超炎症模型发病机制中一个新的免疫代谢层面，与已建立的IFN-γ通路并行运作。

该研究的治疗意义在于修正了将衣康酸作为通用抗炎剂的传统治疗范式。虽然衣康酸在LPS和CpG刺激的巨噬细胞中抑制经典促炎细胞因子，但其对趋化因子的双向调控——放大CXCL10同时抑制CCL2/CXCL1——揭示了情境依赖性的免疫调节谱。在MAS这一病理关键由CD8⁺ T细胞浸润驱动的条件下，衣康酸的主导效应是促进致病性免疫。因此，ACOD1–衣康酸轴成为T细胞驱动超炎性疾病如MAS的合理靶点。阻断核心致病轴CXCL10–CD8⁺ T细胞的益处超过了在该特定情境下可能丧失的衣康酸辅助抗炎效应。这种二分性强调了靶向ACOD1–衣康酸等免疫代谢通路需要生物标志物驱动的患者分层。

研究人员还提出了时间精细化策略的概念框架：在急性超炎症期药理增强ACOD1–衣康酸通路以抑制促炎细胞因子，同时在慢性期选择性抑制该通路以防止CD8⁺/Th17⁺ T细胞驱动的细胞因子/趋化因子损伤。这种时间调制的概念框架表明，治疗目标可能从急性期抑制超炎症转变为疾病后期预防慢性趋化因子驱动组织损伤。

研究结论：该研究发现了SD/MAS中一种衣康酸介导的代谢–免疫交互作用。通过将衣康酸的免疫代谢作用扩展至连接先天免疫过度激活和适应性细胞毒性，该研究为MAS的发病机制提供了新的机制见解，并展示了衣康酸–CXCL10轴作为免疫代谢干预潜在治疗靶点的价值。