《Experimental & Molecular Medicine》：DN203316, a novel PPARδ agonist, suppresses ferroptotic signaling and fibrogenesis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis
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近年研究发现铁死亡(ferroptosis)是驱动代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(metabolic dysfunction-associated steatohepatitis, MASH)的致病机制，但其上游触发因素及其与纤维化的关联尚不清楚。研究人员发现膳食
近年研究发现铁死亡(ferroptosis)是驱动代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(metabolic dysfunction-associated steatohepatitis, MASH)的致病机制，但其上游触发因素及其与纤维化的关联尚不清楚。研究人员发现膳食胆固醇诱导的铁死亡及过氧化物酶体增殖物激活受体δ(peroxisome proliferator-activated receptor delta, PPARδ)下调是MASH发病的核心驱动因素。为此，研究人员并行检测了人肝组织标本、高胆固醇饮食MASH小鼠模型，并在肝细胞与肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)中进行机制研究。胆固醇诱导的MASH伴随明显的肝脂质过氧化及PPARδ选择性下调。PPARδ缺失破坏氧化还原稳态并使肝细胞对铁死亡敏感，而铁死亡肝细胞释放的外泌体双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)激活STING–TBK1–IRF3通路并诱导HSCs中促纤维化基因表达。肝细胞特异性过表达PPARδ或用新型高选择性PPARδ激动剂DN203316进行药物处理可逆转上述效应。体内实验中，DN203316在不引起代谢紊乱的前提下减轻铁死亡、炎症及纤维化。MASH患者肝组织中脂质过氧化显著升高及STING驱动的HSC活化证实了上述发现。综上，PPARδ是MASH中胆固醇诱导铁死亡及外泌体介导的致纤维化信号的关键调节因子，DN203316通过抑制铁死亡、阻断肝细胞–HSC串扰及延缓疾病进展，提供了一种有前景的治疗策略。
一、研究背景与概述
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(metabolic dysfunction-associated steatohepatitis, MASH)，原名非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)，是代谢功能障碍相关脂肪性肝病(metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD)的进展形式，其特征为肝细胞气球样变、小叶炎症及进行性纤维化。目前MASH发病机制复杂，涉及胰岛素抵抗、脂毒性、氧化应激及线粒体功能障碍，其中肝细胞死亡（包括凋亡与非凋亡途径如铁死亡）被认为是启动炎症与纤维化级联反应的核心触发因素。铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，由过度的脂质过氧化及抗氧化防御（特别是谷胱甘肽过氧化物酶4，glutathione peroxidase 4, GPX4）失效所驱动。过氧化物酶体增殖物激活受体δ(peroxisome proliferator-activated receptor delta, PPARδ)是核受体，调控脂质代谢、线粒体功能及炎症相关基因，但PPARδ在MASH铁死亡及肝纤维化中的具体作用尚未明确。本研究旨在探讨肝细胞PPARδ下调是否促进铁死亡并导致HSC活化及肝纤维化，以及新型选择性PPARδ激动剂DN203316在饮食诱导MASH模型中的治疗潜力。该研究发表于《Experimental & Molecular Medicine》。
二、主要关键技术方法
研究人员采用两组人肝组织标本（MASH患者n=5 vs 非MASH对照n=5，来自韩国启明大学东山医院）；构建C57BL/6小鼠高胆固醇饮食(cholesterol-enriched diet, CED, 2.5%胆固醇6天)及高脂高胆固醇(high-fat high-cholesterol, HFHC)饮食诱导MASH模型（14周），通过尾静脉注射AAV8-TBG-PPARδ实现肝细胞特异性PPARδ过表达，并以DN203316(3 mg/kg/天，腹腔注射，第9–14周)进行药物干预；体外使用小鼠AML12及人HepG2肝细胞、人LX2及小鼠原代HSC、原代Kupffer细胞(KCs)，通过siRNA敲低PPARδ或Rab27a，用Fer-1(ferrostatin-1)抑制铁死亡；检测指标包括BODIPY 581/591 C11染色评估脂质过氧化，Western blot检测PPARδ、xCT(SLC7A11)、GPX4、p-STING、p-TBK1、p-IRF3、α-SMA、COL1A1等，qRT-PCR检测mRNA水平，GSH-Glo法测还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)，差速超离心分离肝细胞来源外泌体并以PicoGreen法定量外泌体dsDNA及qPCR定量mtDNA(ND1基因)，免疫组化(IHC)及免疫荧光(IF)分析人鼠肝组织，双荧光素酶报告实验验证PPARδ对xCT启动子的转录调控，Transwell共培养评估肝细胞条件培养基(conditioned medium, CM)对HSC活化的影响。
三、研究结果
Cholesterol-induced ferroptosis and downregulation of PPARδ are key features of MASH（胆固醇诱导的铁死亡及PPARδ下调是MASH的关键特征）
研究人员分析MASH患者及HFHC/CED饮食小鼠肝组织，发现MASH肝组织4-HNE免疫阳性及C11-BODIPY荧光（脂质过氧化标志）显著升高，提示铁死亡发生；同时PPARδ在蛋白及mRNA水平呈时间依赖性显著下调，该现象在人MASH肝组织中也得到验证。表明胆固醇诱导的PPARδ下调与MASH肝铁死亡密切相关。
Suppression of PPARδ mediates cholesterol-induced ferroptosis via impaired antioxidant defense（PPARδ抑制通过损害抗氧化防御介导胆固醇诱导的铁死亡）
体外胆固醇处理AML12和HepG2肝细胞选择性下调PPARδ（PPARα/γ不变），并引起脂质过氧化，仅被铁死亡抑制剂Fer-1挽救。胆固醇下调胱氨酸/谷氨酸逆向转运体xCT及GPX4蛋白与mRNA水平，降低胞内GSH。siRNA敲低PPARδ模拟胆固醇效应——增强脂质过氧化、下调xCT/GPx4，且不激活caspase-3（非凋亡）。证实PPARδ通过调控xCT–GPX4抗氧化轴防止铁死亡。
Activation of PPARδ mitigates cholesterol-induced ferroptosis in hepatocytes via transcriptional upregulation of xCT（激活PPARδ通过转录上调xCT减轻胆固醇诱导的肝细胞铁死亡）
慢病毒过表达PPARδ或给予DN203316处理，恢复胆固醇处理后xCT和GPX4表达及胞内GSH水平，降低脂质过氧化及细胞死亡。双荧光素酶报告实验显示PPARδ结合xCT启动子区的PPAR响应元件并激活其转录，突变该元件则失去激活效应。DN203316的保护作用依赖于PPARδ（siPPARδ可取消该保护）。说明PPARδ直接转录激活xCT，维持抗氧化防御。
Ferroptotic hepatocyte-derived exosomal dsDNA activates STING signaling in HSCs and promotes fibrogenesis in MASH（铁死亡肝细胞来源外泌体dsDNA激活HSC中STING信号并促进MASH中纤维化发生）
胆固醇处理的肝细胞条件培养基(CM)使HSC中α-SMA、纤连蛋白(fibronectin, FBN)、COL1A1上调，该效应被DN203316或Fer-1或PPARδ过表达取消。从铁死亡肝细胞分离的外泌体中dsDNA（含mtDNA组分）含量显著升高，且可被DN203316/Fer-1抑制。该外泌体激活HSC中STING–TBK1–IRF3磷酸化及促纤维化基因，DNase I消化外泌体dsDNA或沉默Rab27a（抑制外泌体分泌）或STING抑制剂SN-011均可阻断此活化。MASH患者肝组织可见p-STING与α-SMA共定位。提示铁死亡肝细胞通过外泌体dsDNA（主要为mtDNA）旁分泌激活HSC中cGAS–STING通路驱动纤维化。
Hepatic overexpression of PPARδ attenuates MASH progression by suppressing ferroptosis and fibrogenesis（肝特异性过表达PPARδ通过抑制铁死亡和纤维化减缓MASH进展）
AAV8-TBG-PPARδ注射的HFHC饮食小鼠肝PPARδ升高，血清ALT/AST下降，肝4-HNE及C11-BODIPY信号减弱，xCT/GPX4及肝GSH恢复，Sirius Red染色及α-SMA、Col1a1表达降低。证明肝细胞PPARδ过表达在体内抑制铁死亡及纤维化。
DN203316 alleviates MASH by suppressing ferroptosis and STING-driven fibrogenesis in a MASH mouse model（DN203316通过抑制铁死亡及STING驱动的纤维化缓解MASH小鼠模型病变）
HFHC饮食小鼠给予DN203316(3 mg/kg/天，5周)后，肝形态改善，血清转氨酶下降，肝脂质过氧化标志物减少，xCT/GPX4恢复，GSH升高，MDA降低；肝纤维化（Sirius Red、α-SMA、Col1a1）显著减轻。分选的原代肝细胞中xCT/GPX4上调，原代HSC中p-STING/p-TBK1/p-IRF3信号受抑；肝组织p-STING与α-SMA共定位减少。表明DN203316在体抑制肝细胞铁死亡及HSC中STING介导的致纤维化信号。
四、讨论与结论总结（翻译研究结论部分）
本研究表明，胆固醇诱导的肝细胞铁死亡是通过PPARδ下调驱动MASH进展的核心致病机制。利用重现人MASH病理生理的饮食模型，研究人员确定了PPARδ–xCT–GPX4轴是氧化还原稳态的关键调节因子，并显示PPARδ的基因激活或药物激活（通过DN203316）可减轻疾病进展。值得注意的是，DN203316抑制铁死亡肝细胞释放含dsDNA的外泌体，从而阻断HSC中STING通路激活。这些发现揭示了一条此前未被认识的将代谢应激与致纤维化信号相联系的轴，并为MASH相关的间质重塑提供了机制性见解。
虽然铁死亡作为慢性肝病治疗靶点日益受到关注，但其在MASH中的上游调控仍不清楚。本研究证明胆固醇负荷诱导肝细胞铁死亡，且该过程可被Fer-1选择性抑制而非凋亡或坏死性凋亡抑制剂，确认铁死亡是胆固醇诱导MASH中肝细胞损伤的主要形式。研究人员发现PPARδ在胆固醇处理的肝细胞及MASH肝组织中选择性下调，提示PPARδ对代谢损伤具有独特易感性。胆固醇通过抑制PPARδ转录活性及加速其mRNA衰减降低PPARδ水平，蛋白降幅大于mRNA降幅，提示可能存在翻译抑制或蛋白降解的额外调控层。PPARδ缺失继而损害xCT–GPX4抗氧化轴的转录调控，导致氧化还原失衡及对铁死亡的易感性增加。尽管经典PPARδ激动剂GW501516和GW0742因致癌性及临床疗效证据不足受限，本研究开发的DN203316是一种具有高选择性（>400倍选择性高于PPARα/PPARγ）、含1,3,4-噻二唑骨架的新型PPARδ激动剂，PPARδ过表达或DN203316处理均有效防护胆固醇诱导的铁死亡并在体内外减轻MASH进展且无 detectable毒性，使其成为铁死亡驱动肝损伤的更具安全性的候选治疗药物。
肝细胞与非实质细胞间的动态互作构成驱动肝纤维化的多细胞网络。本数据显示肝细胞铁死亡的重要下游后果是释放富含dsDNA的细胞外囊泡（外泌体），作为旁分泌介质促进肝细胞–HSC通讯，参与MASH微环境中致纤维化信号传递。与本发现一致，胆固醇诱导的肝细胞铁死亡显著增加含dsDNA外泌体释放，其中含大量mtDNA；恢复PPARδ信号（DN203316）抑制铁死亡及这些囊泡的致纤维化潜能，表明铁死亡肝细胞不仅是受损细胞，还主动塑造基质微环境。
进一步确定STING–TBK1–IRF3信号轴是含dsDNA外泌体激活HSC纤维化的关键下游效应器。铁死亡伴随严重的线粒体质膜过氧化及损伤，促使低甲基化mtDNA释放，mtDNA是cGAS–STING通路的强效配体。研究人员在肝细胞来源外泌体dsDNA中检出显著mtDNA组分，该外泌体激活HSC中STING信号及α-SMA、Col1a1等纤维化基因，抑制铁死亡或恢复PPARδ活性可削弱此反应，与人MASH肝组织p-STING/α-SMA共定位现象相符。
综上所述，本研究确定胆固醇诱导的铁死亡是MASH进展的关键驱动因素，并建立PPARδ为铁死亡易感性的核心调节因子。新型高选择性PPARδ激动剂DN203316可恢复氧化还原平衡、抑制肝细胞来源含dsDNA外泌体释放及STING介导的致纤维化过程。这些发现阐明了代谢应激、铁死亡信号及基质细胞活化之间的机制联系，使DN203316成为代谢肝病治疗临床试验中有前景的候选药物。
