《Gene Therapy》：High resolution ES-DMA quantifies AAV capsid DNA content by electrical mobility to mass correlation
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重组腺相关病毒（recombinant Adeno-Associated Virus, rAAV)是基因治疗领域最主要的病毒载体平台。rAAV生产和质量控制中一个长期存在的挑战是如何准确评估纯化病毒衣壳的DNA含量。即使经过高度纯化的rAAV制剂，也普遍存在空
重组腺相关病毒（recombinant Adeno-Associated Virus, rAAV)是基因治疗领域最主要的病毒载体平台。rAAV生产和质量控制中一个长期存在的挑战是如何准确评估纯化病毒衣壳的DNA含量。即使经过高度纯化的rAAV制剂，也普遍存在空衣壳、部分填充（"partial"）以及过填充（"over-filled"）等杂质物种。这些杂质不仅导致生产成本升高，还会降低治疗效果，使得所需剂量增加并对患者健康造成更大风险。本研究提出将高分辨率电喷雾差分迁移率分析（electrospray differential mobility analysis, ES-DMA）作为一种新型台式分析技术，用于rAAV载体的表征。该技术仅需微升级别的样品量，即可实现埃米（?）尺度的颗粒粒径分析，研究人员证明该分辨率足以通过差分电迁移率分辨rAAV的DNA包封情况。研究人员将该方法与电荷检测质谱（charge detection mass spectrometry, CD-MS）——一种新兴的rAAV分析金标准——进行了对比验证，发现气溶胶化rAAV颗粒的电迁移率与质量之间存在稳健的近线性相关关系。这一关系使得ES-DMA能够快速识别并相对定量空衣壳、完整衣壳以及部分/过填充rAAV衣壳。
本研究聚焦于重组腺相关病毒（rAAV）载体质量控制中的关键科学与技术问题，开发并验证了一种基于高分辨率电喷雾差分迁移率分析（ES-DMA）的新型分析方法。该论文发表于《Gene Therapy》期刊，对于推动基因治疗载体的精准表征具有重要意义。
研究背景方面，腺相关病毒（AAV)是一种直径约25纳米的无包膜二十面体细小病毒，可包封约4.7千碱基（kb）的单链DNA基因组。由于其非致病性、相对较低的免疫原性以及广泛的组织嗜性，AAV已成为基因治疗中最常用的病毒载体。目前美国食品药品监督管理局（FDA）已批准7款基于AAV的基因治疗产品用于治疗多种罕见遗传病。然而，尽管AAV基因治疗展现出潜在的治愈前景，其更广泛公共卫生影响的实现仍面临阻碍，主要原因在于治疗效果有限以及开发和生产这些复杂生物药物产品的成本极高。值得关注的是，尽管AAV载体通常被认为具有良好的安全性，但在高剂量给药时仍发生了数例患者死亡事件。研究人员指出，rAAV衣壳DNA含量的异质性可能是导致这些安全风险的关键因素，因为这种异质性会削弱临床前研究和临床试验数据的可重复性与可解释性。
准确评估和优化rAAV衣壳的"空/满比率"长期以来一直是生产中的持续性挑战。大量空衣壳经常与所需的完整颗粒共纯化，这些空衣壳可能增加患者的抗AAV免疫原性及相关毒性，却无法提供任何治疗效果。此外，近期研究认识到，除空/满衣壳外，"部分填充"和"过填充"衣壳的检测与定量同样迫切需要新型分析技术。这些污染颗粒可能含有特征不清且潜在有害的遗传物质，包括截短的治疗性转基因和/或质粒DNA载体组分。尤为重要的是，由于这些功能失调的物种往往包封了部分或全部所需的DNA转基因，它们还会干扰基于定量PCR（qPCR）的AAV滴度和空/满颗粒比率测定，从而人为地夸大"完整"衣壳的比例，同时削弱产品的效力和安全性。
现有技术各有局限：负染电子显微镜（EM)通量低且无法可靠定量部分和过填充物种；尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SEC-MALS)对空/满比率的估计同样受到未分辨的部分/过填充衣壳的干扰；质量光度法虽能检测部分/过填充衣壳，但定量结果对样品配方和杂质敏感；分析型超速离心（AUC)可能是目前检测部分/过填充物种分辨率最高的方法，但需要较大的样品量和较长的运行时间，且依赖专业设备和复杂的分析过程；电荷检测质谱（CD-MS)作为新兴金标准，虽然能提供明确的高质量蛋白组装体质量分析，但商业化系统直至近期才出现。因此，多种正交技术的联合应用对于全面表征rAAV载体仍然至关重要。
在此背景下，研究人员假设在ES-DMA分析的电喷雾电离和气溶胶化过程中，AAV颗粒会发生部分脱水和围绕包封DNA货物的结构压实，从而产生与DNA含量对应的可测量电迁移率差异。ES-DMA是一种成熟的纳米颗粒表征方法，可实现亚纳米级粒径分析和定量。在该技术中，分析物通过纳米电喷雾电离从水溶液电解质转移至气相，带电液滴在中性气氛中经历溶剂蒸发和电荷平衡，最终大部分分析物带单一电荷，从而降低谱图复杂度。随后，主要带单电荷的颗粒流进入差分迁移率分析仪（DMA），在鞘流气和垂直电场（"DMA电压"）的共同作用下，根据电泳迁移率进行分离。DMA内电极电压的变化使其作为可调谐的迁移率带通滤波器运作，仅将特定电迁移率的颗粒传输至检测器。连接DMA出口的凝聚核颗粒计数器（CPC）通过检测超饱和气氛中颗粒诱导成核形成的液滴散射光，实现单颗粒定量。
研究人员采用了一种新型台式高分辨率ES-DMA平台NanoRanger，对多种AAV制剂进行了表征，并与CD-MS进行了平行测试，以基准验证ES-DMA定量AAV衣壳含量的能力。
在技术方法层面，本研究采用了以下关键技术：高分辨率电喷雾差分迁移率分析（ES-DMA)，使用NanoRanger系统，在受控湿度条件（约40%相对湿度）下进行，通过200个电压步进在?4.0至?5.8 kV范围内进行高分辨率采集；电荷检测质谱（CD-MS)，使用配备嵌入式检测圆柱的静电线性离子阱仪器，通过纳米电喷雾电离引入样品，以130 eV/z的离子能量和104.6 ms的捕获时间进行测量，采用MICE算法进行数据处理；以及多峰高斯拟合的谱图分析方法，用于峰识别、定量和比较。样品来源于商品化的rAAV9制剂，包含名义上0-5.0 kb不同长度基因组负载的12个样本，以及经过认证的rAAV9空衣壳参考标准品。所有样品在分析前均用2%多聚甲醛（PFA）固定，部分样品也制备了未固定的对照版本进行比较。
研究结果部分，研究人员首先评估了标称负载约5.0 kb转基因（CMV7-spCas9)的商用"完整"rAAV9制剂。ES-DMA谱图显示了重复的显著峰，位于对应1/n（1/2、1/3、1/4…）比例的电压位置，识别为单电荷、双电荷、三电荷等物种。单电荷区域（?4.25至?5.8 kV）为后续分析的主要关注区域。单电荷rAAV9颗粒呈现多峰分布，与空衣壳/部分填充/完整衣壳混合物的存在一致。通过与rAAV9认证空衣壳参考标准的比较，研究人员确认最小电泳迁移率直径（EMD)峰与空衣壳参考标准对齐，而最大EMD峰对应于完整颗粒。
为验证rAAV衣壳DNA含量与颗粒粒径的关系，研究人员对名义上含有不同长度DNA货物的rAAV9样本面板进行了CD-MS和ES-DMA的平行分析。结果显示，两种方法的谱图存在清晰的对应关系，且高分辨率ES-DMA的粒径表征能够产生与CD-MS质谱图高度相似的峰形轮廓。通过将各样本中识别的对应质量-粒径峰对进行绘制，研究人员发现了DNA包封rAAV的显著近线性质量-粒径相关关系（R2 = 0.992），并建立了迁移率直径与粒子质量、以及迁移率直径与包封DNA长度（kb)之间的定量数学关系。在定量方面，峰面积计算的各种物种相对丰度在CD-MS和DMA之间显示出高度一致性。
关于峰值宽度和分辨率，研究发现CD-MS和ES-DMA之间存在差异。对于标称满载（~4.7 kb)的rAAV制剂，CD-MS和ES-DMA清晰分辨基因组截短的极限分别约为~350核苷酸（nt）和~500 nt。此外，ES-DMA观察到的空衣壳颗粒具有比其缩放直径分辨率更大的质量分辨率，这可能归因于空衣壳在气相转变过程中衣壳壳层结构压实不完全，导致相对单分散的质量分布呈现出多种空气动力学截面。
在讨论部分，研究人员首先强调了rAAV载体在基因治疗中的重要地位及其面临的制造和分析表征挑战。空衣壳、部分填充和过填充衣壳的存在降低了治疗效力、扭曲了剂量定量，并增加了免疫原性风险。尽管已有多种分析技术应用于该问题，但各自在灵敏度、分辨率、通量、可用性或成本方面存在局限，多种检测方法的平行应用已成为标准做法。
本研究的核心贡献在于建立了高分辨率ES-DMA作为一种有前景的新型分析手段，能够通过气相电迁移率这一全新且正交的参数来分辨衣壳物种。通过与CD-MS的并行测试，研究人员证明了ES-DMA量化的电迁移率与气溶胶化rAAV颗粒质量直接相关，从而能够稳健地识别和相对定量空衣壳、完整衣壳、部分填充和过填充衣壳。质量-直径关系可用线性拟合很好地近似，这可能是因为相关的迁移率直径范围（~23.3-25.6 nm）过窄，不足以出现m∝d3标度的显著偏离。值得注意的是，空衣壳颗粒偏离了DNA包封物种所观测到的近完美线性关系，这可能是由于气相压实不完全所致，这也进一步凸显了高分辨率ES-DMA揭示构象异质性结构信息的能力。
研究人员还观察到，在CD-MS丰度约50%的峰面积附近，ES-DMA定量倾向于略高的估计值。这一效应可部分归因于ES-DMA相对较低的分辨能力导致低丰度中间物种被纳入"完整"峰中，同时也受到所用基于高斯拟合定量模型局限性的影响。CD-MS此前已展现出分辨亚350 nt基因组截短的能力，而本研究中ES-DMA能够部分分辨偏离名义货物负载约900 nt的偏差。然而，由于满载rAAV衣壳高度单分散的峰形特征，ES-DMA识别出的任何异常宽化的"完整"峰也可用于标记可能存在截短的rAAV批次，极限可能在~300-500 nt量级。
ES-DMA的独特优势还在于能够在环境压力下进行分离，从而具备在仪器出口收集按粒径分离的颗粒进行正交检测（如qPCR、电子显微镜或DNA测序）的能力。这一特性有望用于表征部分/过填充衣壳的DNA序列信息，进一步帮助研究人员在生产过程中消除这些杂质，从而降低AAV治疗产品的成本并提高安全性。
研究结论部分，研究人员总结指出，高分辨率ES-DMA可作为研究人员和生产团队评估和改进rAAV制剂质量的有力工具。除AAV应用外，研究人员预期，通过台式高分辨率ES-DMA系统实现对复杂生物制品的亚纳米级粒径分析的更广泛可及性，将在基础研究和生物制药工业中找到广泛应用。
